IL-17等炎性因子在風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少骨髓細(xì)胞中的分泌狀態(tài)及其臨床意義①

孫黎飛 孫志宏 吳強(qiáng)強(qiáng) 張曉席 杜延會(huì) 王桂臣

(解放軍第148醫(yī)院腫瘤中心，淄博255300)

隨著對(duì)風(fēng)濕免疫性疾病的認(rèn)識(shí)和研究不斷提高，風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少(Rheumatism immune-related hematocytopenia，RIRH)的發(fā)病率也逐年增高。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，部分RIRH患者伴有血清HLA-B27升高，且端粒酶活性增強(qiáng)，較之血清HLAB27陰性者造血細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重[1，2]，在血清 IgG升高的患者骨髓中伴有不同造血細(xì)胞島出現(xiàn)[3]。本文進(jìn)一步觀察了該類患者血清中炎性因子的含量和骨髓中免疫細(xì)胞表達(dá)炎性因子的狀態(tài)，探討其與RIRH骨髓造血細(xì)胞損傷的關(guān)聯(lián)和臨床診療的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 66例RIRH為2009年～2012年我院診治患者，男性20例，女性46例，年齡范圍36～72歲;全血細(xì)胞減少32例，兩系減少34例。外周血WBC(0.7～3.2)×109L-1，HB(35～102)g/L，PLT(30～238)×109L-1;其中伴有干燥綜合征者19例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎30例，風(fēng)濕性心臟病17例。27例WBC＜2.0×109L-1，伴肺部或尿路感染者血清IgG和血沉(ESR)顯著增高。21例間斷服用糖皮質(zhì)激素，28例伴血清HLA-B27增高(影像學(xué)排除強(qiáng)直性脊柱炎)。血清對(duì)照組30人選自我院查體中心健康標(biāo)本，年齡20～50歲，男性15人，女性15人。

1.2 主要試劑和器材 血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ酶免(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司，羊抗人HLA-DR單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Beyotime公司，羊抗人IgG抗體、驢抗羊IgG熒光二抗(Cy3)、小鼠抗人FcγⅡR、羊抗小鼠IgG熒光二抗(FITC)、小鼠抗人甘露糖受體(Mannose receper，MR，PE)、ICAM-1(PE)、IL-12(AF488)、IL-17A(FITC)和IL-17RA(PE)單克隆免疫熒光(Immunofluorescence，IF)抗體均購(gòu)自美國(guó)SANTA公司。

1.3 檢測(cè)血清細(xì)胞因子含量 留取患者空腹靜脈血清，-80℃保存，1周內(nèi)ELISA方法檢測(cè)其治療前后血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17 和 IFN-γ 含量，每孔標(biāo)本設(shè)3孔，波長(zhǎng)450nm讀取3孔OD均值，標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品濃度。

1.4 分析骨髓免疫細(xì)胞活化狀態(tài)和免疫分子表達(dá)留取患者治療前和治療4周后骨髓涂片，聯(lián)苯胺法過(guò)氧化物酶(Peroxydase，POX)染色，觀察免疫細(xì)胞POX活性;免疫化學(xué)(IC)法檢測(cè)免疫細(xì)胞HLADR抗原表達(dá)，IF法檢測(cè)骨髓細(xì)胞抗人IgG抗體、FcγⅡR、MR、ICAM-1、IL-12、IL-17A 和 IL-17RA 等免疫分子表達(dá)，缺鐵性貧血骨髓片為疾病對(duì)照。

1.5 藥物治療原則

1.5.1 免疫抑制劑和對(duì)癥支持 ①根據(jù)患者病情予以糖皮質(zhì)激素治療，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，抑制免疫細(xì)胞活化;至血象恢復(fù)后，逐漸遞減;血清HLA-B27和血清IgG升高者，及時(shí)聯(lián)合環(huán)孢素A(CsA)口服，抑制T輔助細(xì)胞活化。②伴有感染灶，發(fā)熱、WBC顯著下降者，根據(jù)藥敏選擇抗生素和(或)聯(lián)合抗病毒藥物治療。③原發(fā)病和對(duì)癥支持治療。

1.5.2 復(fù)方丹參干預(yù)改善骨髓血管炎性病變 32例血小板計(jì)數(shù)＞50×109L-1，無(wú)出血傾向者在上述治療方案同時(shí)聯(lián)合復(fù)方丹參(四川和升制藥)30 ml/qd靜滴，促進(jìn)患者體內(nèi)和骨髓造血微環(huán)境炎性因子的清除，隨機(jī)抽取未加復(fù)方丹參治療組30例RIRH作為治療對(duì)照組，兩組年齡范圍、性別比例和病情基本相似。每周復(fù)查兩組患者血清IL-5和IL-17含量及外周血象，4周后隨訪兩組骨髓象變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIRH患者血清中多種炎性因子升高 患者入院時(shí)血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17 和 IFN-γ 分別為(126.04±7.66)ng/L、(316.23±25.163)ng/L、(328.43±27.01)ng/L、(48.17±4.22)ng/L和(40.28±3.69)ng/L，較之對(duì)照組顯著升高，P值均＜0.05。經(jīng)藥物治療4周至血象恢復(fù)時(shí)，上述細(xì)胞因子分別下降至(58.21±5.14)ng/L、(188.13±12.51)ng/L、(96.01±6.76)ng/L、(26.01±4.23)ng/L和(9.13±2.55)ng/L，接近對(duì)照組(詳見(jiàn)表1)，P＞0.05。66例患者中IL-5和IL-17升高率為100%(66/66)，IL-12 升高率為 97.0%(64/66)，而IL-10和 IFN-γ升高率分別為66.67%(44/66)和69.69%(46/66)，較前者差異顯著，P＜0.05。

2.2 RIRH患者骨髓免疫細(xì)胞活化特點(diǎn)

2.2.1 組織嗜堿細(xì)胞(肥大細(xì)胞，Mast cell，MC)增多與IL-10升高密切相關(guān) 患者骨髓中MC數(shù)量增多，分類約為(3.2±0.08)%，顯著高于疾病對(duì)照組(0.6±0.05)%，P＜0.05;活化的MC通過(guò)粘附、捕獲和釋放嗜堿性顆粒攻擊病變血細(xì)胞(圖1 A～D)，且與血清IL-10升高水平密切相關(guān)r=0.885。

2.2.2 嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophile granulocyte，EOS)增生活躍 患者骨髓中EOS分類約為(7.4±3.1)%，高于對(duì)照組(2.4±1.6)%，P＜0.05?；罨腅OS特異性顆粒POX活性增強(qiáng)，粘附、捕獲和吞噬著病變的中性粒細(xì)胞(圖1E)、血小板(圖1F箭頭)和紅細(xì)胞(圖1G箭頭)，被攻擊的病變中性粒細(xì)胞POX活性顯著減弱(圖1H箭頭)。

2.2.3 巨噬細(xì)胞(Mφ)形態(tài)奇異 部分患者由于間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，其骨髓中POX陽(yáng)性形態(tài)怪異的Mφ(圖2A～C)多見(jiàn)，伴有感染者骨髓中可見(jiàn)到巨大活化狀態(tài)的Mφ募集各種炎性細(xì)胞現(xiàn)象(圖2D)。

2.2.4 伴有感染者免疫細(xì)胞高表達(dá)HLA-DR 活化狀態(tài)的 DC(圖2E)、Mφ(圖2F)和 MC(圖 2G)HLA-DR呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。伴感染者骨髓造血細(xì)胞島中高表達(dá)HLA-DR的巨大Mφ捕獲病變血細(xì)胞現(xiàn)象多見(jiàn)(圖2H)。間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療者，骨髓中約1/2的DC、Mφ不表達(dá)HLA-DR。

2.2.5 RIRH患者骨髓中免疫細(xì)胞捕獲表達(dá)抗人IgG病變血細(xì)胞現(xiàn)象多見(jiàn) 部分病變的血細(xì)胞膜抗人IgG IF呈帶狀陽(yáng)性，EOS(圖2A)和MC(圖2B)特異性顆粒結(jié)合大量抗人IgG IF，活化的DC(圖2C)和Mφ粘附捕獲病變血細(xì)胞現(xiàn)象多見(jiàn);血清IgG顯著升高者骨髓中，造血細(xì)胞島中Mφ與病變血細(xì)胞連接處大量抗人IgG IF沉積(圖2D)，對(duì)照組骨髓造血細(xì)胞膜抗人IgG IF陰性。

2.2.6 RIRH患者骨髓中活化的免疫細(xì)胞高表達(dá)FcγⅡR 缺鐵性貧血和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者骨髓中Mφ低表達(dá)FcγⅡR(圖3F)，伴有感染血清IgG升高的RIRH患者骨髓中，活化的Mφ表達(dá)FcγⅡR的數(shù)量顯著增多(圖3G)，與病變的造血細(xì)胞結(jié)合形成巨大的Mφ型造血細(xì)胞島多見(jiàn)(圖3H)，提示感染加重造血損傷?；罨腄C不表達(dá)FcγⅡR，而EOS則強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖3E)。

2.2.7 RIRH患者骨髓中活化的免疫細(xì)胞高表達(dá)MR 缺鐵性貧血和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者骨髓中DC和Mφ呈顆粒狀弱表達(dá)MR(圖3J)，伴有感染的RIRH患者骨髓中DC(圖3I)、EOS(未顯示)和Mφ(圖3K)表達(dá) MR的數(shù)量顯著增多，在 IgG和ESR升高的全血細(xì)胞減少RIRH患者骨髓中，由高表達(dá)MR的Mφ與病變血細(xì)胞組成的造血細(xì)胞島多見(jiàn)(圖3L)，提示造血損傷加重。

表1 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果(ng/L)Tab．1 Serumal level of cytokines(ng/L)

圖1 RIRH患者骨髓中活化的組織嗜堿細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞(×1 000)Fig．1 Activated tissue basophil and eosinophil in bonemarrow of RIRH patients( ×1 000)

圖2 RIRH患者骨髓中奇異的Mφ和免疫細(xì)胞HLA-DR表達(dá)情況(×1 000)Fig．2 Weird expression of HLA-DR on Mφ and other immunocyte in marrow of RIRH patients( ×1 000)

圖3 RIRH患者骨髓中免疫細(xì)胞表達(dá)IgG、FcγⅡR和MR(×1 000)Fig．3 IgG，F(xiàn)cγⅡR and MR were observed to be expressed by immunocyte in marrow of RIRH patients( ×1 000)

2.2.8 感染促進(jìn)粘附分子ICAM-1表達(dá) 伴有感染的RIRH患者骨髓中活化的DC(圖4A)、EOS(圖4B)和Mφ(圖4C)高表達(dá)粘附分子ICAM-1，缺鐵性貧血與間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的RIRH患者，上述免疫細(xì)胞呈顆粒狀弱表達(dá)ICAM-1(圖4D)，提示感染可上調(diào)粘附分子表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞參與對(duì)造血細(xì)胞的炎性反應(yīng)過(guò)程。

2.2.9 RIRH患者骨髓免疫細(xì)胞高表達(dá)IL-12和IL-17A及其受體 骨髓中DC(圖4E)、EOS(圖4F)和Mφ(圖4G)胞漿中呈分泌狀表達(dá)IL-12，缺鐵性貧血患者骨髓中DC和EOS不/弱表達(dá)，Mφ呈灶性弱表達(dá)(圖4H)。缺鐵性貧血和血清IgG升高骨髓呈體液免疫活化優(yōu)勢(shì)狀態(tài)的RIRH患者骨髓中，DC不表達(dá)IL-17A，而在血清HLA-B27升高的RIRH患者骨髓中，活化的DC(圖4I)、EOS(圖4J)和Mφ(圖4K)均高表達(dá)IL-17A，缺鐵性貧血患者骨髓中僅少量造血細(xì)胞表達(dá)IL-17RA，伴有感染的RIRH患者骨髓細(xì)胞中廣泛表達(dá)IL-17RA(圖4L)，提示感染使IL-17A與IL-17RA結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量增多，能放大由其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

2.3 藥物治療效果

2.3.1 經(jīng)糖皮質(zhì)激素聯(lián)合抗感染等藥物治療1周后，患者血清IgG和ESR逐漸下降，血象逐漸恢復(fù)直至正常。伴有HLA-B27升高全血細(xì)胞減少的RIRH患者血象恢復(fù)遲緩，經(jīng)聯(lián)合CsA治療4周后，患者血象開(kāi)始恢復(fù);復(fù)查骨髓可見(jiàn)EOS的POX活性減弱，Mφ核凋亡現(xiàn)象多見(jiàn)，2/3的 DC和 Mφ HLA-DR轉(zhuǎn)陰。

圖4 免疫細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、IL-12、IL-17A和IL-17RA(×1 000)Fig．4 ICAM-1，IL-12，IL-17A and IL-17RA were expressed by immunocyte in marrow of RIRH patients(×1 000)

圖5 聯(lián)合復(fù)方丹參治療對(duì)患者血清炎性因子清除的動(dòng)態(tài)觀察Fig．5 The analysis of compound Salvia miltiorrhiza to remove serumal inflammatory factors

2.3.2 復(fù)方丹參聯(lián)合免疫抑制劑治療能促進(jìn)患者血清炎性因子清除 32例RIRH聯(lián)合復(fù)方丹參治療2周以后，血清IL-5和IL-17含量較之未聯(lián)合復(fù)方丹參組顯著降低(圖5)，血象恢復(fù)時(shí)間較之未聯(lián)合復(fù)方丹參組提前1周，骨髓中表達(dá)IL-17A和IL-17RA的免疫細(xì)胞及造血細(xì)胞比例，較之對(duì)照組顯著減少。兩組間差異顯著，P＜0.05。

3 討論

風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病是各種致病因素誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的自身免疫性疾病狀態(tài)。患者體內(nèi)存在針對(duì)自身成分產(chǎn)生的自身抗體和/或自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，能介導(dǎo)對(duì)自身細(xì)胞或組織成分獲得性免疫應(yīng)答。由于疾病慢性遷延和反復(fù)發(fā)作，以及自身抗體的分子模擬和抗原表位擴(kuò)展，最終累及造血系統(tǒng)，致使患者體內(nèi)部分血細(xì)胞膜抗原結(jié)構(gòu)改變，引發(fā)了針對(duì)病變血細(xì)胞(靶細(xì)胞)的風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少(RIRH)超敏反應(yīng)病理過(guò)程和疾病狀態(tài)，感染免疫活化能加重對(duì)造血細(xì)胞的免疫損傷作用[4]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，該類患者除伴有自身免疫性疾病外，臨床主要表現(xiàn)為外周血兩系或三系(全血細(xì)胞)減少，骨髓增生活躍，組織嗜堿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞活化。部分患者由于間斷服用糖皮質(zhì)激素，骨髓中漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞形態(tài)異常，功能受抑。而伴WBC減少的患者骨髓中，活化的嗜酸性粒細(xì)胞攻擊POX活性減弱或消失的病變中性粒細(xì)胞現(xiàn)象增多，是RIRH患者重要的骨髓特征，同時(shí)也提示嗜酸性粒細(xì)胞在RIRH造血細(xì)胞損傷病理過(guò)程中，起到至關(guān)重要的作用。

我們的研究結(jié)果顯示，RIRH患者由于長(zhǎng)期處于免疫紊亂狀態(tài)，其血清中 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ等多種與自身免疫相關(guān)聯(lián)的炎性因子升高，其中促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞增殖的IL-5和作為炎性介質(zhì)的IL-17的升高率為100%，而活化細(xì)胞免疫的炎性因子IL-12升高率為97.0%，表明這些介導(dǎo)自身免疫性炎性因子與RIRH造血細(xì)胞炎性損傷的病理過(guò)程密切關(guān)聯(lián)[5，6]。

我們的研究結(jié)果還顯示，由于患者體內(nèi)存在針對(duì)自身病變?cè)煅?xì)胞膜的IgG抗體，其骨髓中部分病變血細(xì)胞膜抗人IgG IF陽(yáng)性表達(dá)，誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生，由于原發(fā)病導(dǎo)致患者體內(nèi)免疫紊亂狀態(tài)，多種免疫細(xì)胞活化，以不同方式攻擊病變血細(xì)胞，是RIRH骨髓造血細(xì)胞病理性損傷重要的特征。部分患者由于WBC減少和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，極易并發(fā)感染加重病情?；颊吖撬柚芯奘杉?xì)胞可上調(diào)表達(dá)FcγⅡR和 MR，介導(dǎo) ADCC效應(yīng);上調(diào) ICAM-1表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)病變血細(xì)胞的粘附、捕獲和吞噬，是患者造血細(xì)胞破壞的重要方式[7-9]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，RIRH患者骨髓中，活化的免疫細(xì)胞高表達(dá)IL-12和IL-17A，提示其可能具有分泌這些炎性介質(zhì)的功能;能通過(guò)介導(dǎo)骨髓造血微環(huán)境的血管炎性病變，影響造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，損傷和破壞病變?cè)煅?xì)胞，亦為該類患者骨髓造血細(xì)胞破壞的另一重要因素。

藥物治療結(jié)果及IL-5和IL-17追蹤分析指標(biāo)表明，在抗感染、應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和CsA等藥物，抑制免疫細(xì)胞對(duì)造血細(xì)胞破壞作用同時(shí)，對(duì)血小板＞50×109L-1無(wú)出血傾向患者，謹(jǐn)慎聯(lián)合復(fù)方丹參等活血化瘀藥物治療，有利于炎性因子的代謝和清除，改善骨髓造血微環(huán)境，促進(jìn)疾病恢復(fù)。

1 孫黎飛，韓 冰，吳強(qiáng)強(qiáng) et al.人類白細(xì)胞抗原B27在免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少患者診療中的意義[J].中華內(nèi)科雜志，2012;51(7):557-559.

2 孫黎飛，韓 冰，吳強(qiáng)強(qiáng)et al.免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少患者骨髓造血細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)的臨床意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2012;92(36):2530-2533.

3 孫黎飛，韓 冰，李 鋼et al.骨髓造血細(xì)胞島在免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少患者中的異質(zhì)性研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012;28(5):300-304.

4 何 維主編.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:318-321.

5 Deng I，Younge B R，Olshen R A et al.Th17 and Th1 T-cell responses in gaint cell arterritis[J].Circulation，2010;121:906-915.

6 Ekinici N S.IL-17A has an important role in the acute attacks of Behcet`s disease[J].Rheumatology，2011;50:293-298.

7 Crespo H，Jauregui P，Glaria I et al.Mannose receptor may be involved in small ruminant lentivirus pathogenesis[J].Vet Res，2012;43(1):43.

8 Giraldi-Guimares A，de Freitas H T，Coelho Bde P et al.Bone marrow mononuclear cells and mannose receptor expression in focal cortical ischemia[J].Brain Res，2012;1452:173-184.

9 Liu Z，Ma Y，Moyer M P et al.Involvement of the mannose receptor and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway of the microdomain of the integral membrane protein after enteropathogenic Escherichia coli infection [J].Infect Immun，2012;80(4):1343-1350.