促紅細胞生成素對荷瘤小鼠免疫功能的影響①

劉月彩 耿玉蘭 劉澤世 沈 莉 單保恩 (河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院檢驗科，石家莊050031)

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多種因素作用的結果。機體免疫功能在控制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展方面發(fā)揮著重要的作用，機體免疫監(jiān)視功能的下降，腫瘤細胞產(chǎn)生的免疫抑制因素以及腫瘤細胞的免疫逃逸作用等是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的原因之一[1，2]，因此，提高機體的免疫功能，就有可能起到抗腫瘤的作用。促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種分子量約為30.4 kD的糖蛋白激素，EPO主要生理功能是作用于骨髓造血細胞，促進紅系祖細胞增殖、分化和成熟，臨床上主要用于治療腎臟疾病、癌癥及放化療等引起的貧血。EPO對提高血紅蛋白水平，減少輸血需求，提高患者生活質量發(fā)揮著重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)，EPO 對免疫系統(tǒng)有著廣泛的影響[3，4]，但對免疫系統(tǒng)影響主要來自于EPO治療腎衰竭貧血患者的研究，而有關EPO對腫瘤患者免疫功能影響的研究鮮有報道。本文旨在探討EPO對荷瘤小鼠紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、紅細胞壓積(Hct)、血紅蛋白(Hb)含量、T淋巴細胞亞群分布和血清細胞因子含量的影響，以期對EPO用于臨床治療腫瘤相關性貧血和估計預后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠黑色素瘤細胞株B16由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心提供，5～6周齡C57BL/6小鼠，雄性，體重18～20 g，購自中科院北京實驗動物中心(合格證號:Scxk京-2005-0013);RPMI1640和胰蛋白酶購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司;EPO購自華北制藥有限公司;FITC標記的抗小鼠CD8單克隆抗體(mAb)及PE標記的CD4 mAb均購自eBioscience公司;小鼠TNF-α和IL-2 ELISA試劑盒購自ADL公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) B16細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶消化細胞傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 動物實驗 C57BL/6小鼠18只隨機分為3組:正常對照組、鹽水處理組和EPO處理組，每組6只。除正常對照組外每只小鼠右前腋皮下注射B16細胞1×106個/0.2 ml。每天觀察小鼠成瘤情況。鹽水處理組:按EPO用法和用量腹腔內注射生理鹽水。EPO處理組:于第5天觀察到小鼠成瘤后，腹腔注射EPO 60 U/kg，每周3次，連用2周，其用法和用量參考文獻[5]。正常對照組:不做任何處理。每天觀察小鼠的一般狀況。

1.2.3 小鼠外周血中RBC、Hb、Hct和WBC的測定于停藥后次日，將各組小鼠摘眼球放血，EDTA抗凝，應用 ACTdiff2血細胞分析儀測定外周血中RBC、Hb、Hct和 WBC 含量。

1.2.4 EPO對小鼠脾臟臟器指數(shù)的影響 取血后將各組小鼠處死，準確稱量動物體重、脾臟重量，按公式計算脾臟臟器指數(shù)。脾臟臟器指數(shù)(Spleen index，SI)=脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.2.5 小鼠脾臟T細胞亞群的檢測 將各組小鼠處死后，無菌摘取脾臟，制備脾細胞懸液，調整細胞濃度為1×107ml-1，取0.1 ml于試管中，分別加入熒光標記的小鼠抗CD4+和CD8+T單克隆抗體，振蕩混勻，室溫避光放置30分鐘，PBS洗滌后，用流式細胞儀分析脾淋巴細胞CD4+、CD8+T百分率，計算CD4+/CD8+T比值。

1.2.6 小鼠血清TNF-α和IL-2含量測定 將1.2.3所取血液靜置后離心(3 000 r/min，10分鐘)，取血漿，用ELISA檢測試劑盒測定血清中TNF-α、IL-2的含量，按試劑盒說明進行操作。在酶標測試儀上測定各樣本492 nm處吸光度值。根據(jù)標準曲線計算出血清中細胞因子的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結果以±s表示，兩個獨立樣本均數(shù)比較用t檢驗，各組均數(shù)間比較用單因素方差分析。P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 EPO對小鼠外周血中 RBC、Hb、Hct和 WBC的影響 與正常小鼠相比，鹽水處理組小鼠RBC、Hb和Hct水平顯著降低(P＜0.05);與鹽水處理組相比，EPO可有效提高荷瘤小鼠RBC、Hb和Hct水平(P＜0.05)，與正常小鼠相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。三組小鼠外周血中WBC數(shù)量無明顯差異(P ＞0.05，表1)。

2.2 EPO對小鼠脾臟臟器指數(shù)的影響 EPO處理組和鹽水處理組荷瘤小鼠的脾臟重量較正常對照組增加，脾臟臟器指數(shù)明顯高于正常小鼠(P＜0.05)。EPO處理組小鼠的脾臟臟器指數(shù)明顯高于鹽水處理組(P ＜0.05，表1)。

2.3 EPO對小鼠脾T細胞亞群的影響 鹽水處理組及EPO處理組荷瘤小鼠脾臟CD4+T細胞百分率及CD4+/CD8+T比值明顯低于正常小鼠(P＜0.05)，EPO處理組與鹽水處理組相比，CD4+T小鼠脾細胞百分率無差別(P＞0.05)，CD8+T細胞百分率下降(P＜0.05)，CD4+/CD8+T比值升高(P＜0.05，圖1和表2)。

2.4 EPO對小鼠血清中細胞因子含量的影響 鹽水處理組及EPO處理組荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2含量明顯低于正常小鼠(P＜0.05)，鹽水處理組及EPO處理組荷瘤小鼠血清中TNF-α含量無差別(P＞0.05)，EPO處理組小鼠血清中IL-2水平與鹽水處理組相比明顯增高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05，圖2)。

表1 EPO對荷瘤小鼠外周血中RBC、Hb、Hct和WBC及脾臟臟器指數(shù)的影響Tab．1 Effects of EPO on levels of RBC，Hb，Hct and WBC in peripheral blood and spleen index in tumor-bearing mice

圖1 EPO對小鼠脾T細胞亞群的影響Fig．1 Effects of EPO on T cell subsets of mice spleen analyzed by FCM

表2 EPO對小鼠脾T細胞亞群的影響Tab．2 Effects of EPO on T cell subsets of mice spleen

圖2 EPO對小鼠血清中TNF-α和IL-2含量的影響Fig．2 Effects of EPO on TNF-α and IL-2 level in serum from mice

3 討論

促紅細胞生成素是治療腎性貧血的首選藥物，近年來用于腫瘤相關性貧血的治療也取得較好的效果[6]。近來研究發(fā)現(xiàn)，EPO及EPOR廣泛分布在非紅細胞類型的細胞上[7]。不但對血液系統(tǒng)，而且對免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均有影響[3，4，8-10]。本實驗采用 C57BL/6 小鼠黑色素瘤細胞B16皮下移植瘤模型，從脾臟重量的變化、T細胞亞群分布、細胞因子分泌等方面研究EPO對小鼠免疫功能的影響。

本研究結果顯示，鹽水處理組荷瘤小鼠外周血RBC、Hb和Hct水平比正常對照組顯著降低;與鹽水處理組相比，EPO可有效提高小鼠外周血RBC、Hb和Hct水平，與正常對照組相比無差別。但EPO并未顯著影響小鼠外周血中WBC的數(shù)量，三組小鼠外周血中WBC的數(shù)量沒有明顯差別。荷瘤小鼠脾臟重量較正常對照組增加，脾臟臟器指數(shù)明顯高于正常小鼠。EPO處理組小鼠的脾臟臟器指數(shù)較鹽水處理組增高，可能與其提高血液中RBC、Hb和Hct有關。

T細胞是構成免疫防御系統(tǒng)的重要因素，也是機體抗腫瘤特異性免疫應答的主體，包括CD4+輔助性T細胞和CD8+抑制性T細胞兩個主要亞群，CD4+T細胞具有調節(jié)免疫反應活性、分泌細胞因子的作用，處于整個腫瘤免疫的核心位置，而CD8+T細胞則有免疫抑制和細胞毒性作用，二者相互變化、協(xié)調以維持機體的免疫平衡。本研究結果顯示，EPO對荷瘤小鼠脾臟CD4+T細胞百分率無影響，EPO處理組荷瘤小鼠脾臟CD8+T細胞百分率與鹽水處理組相比下降，致使CD4+/CD8+T比值水平升高。提示EPO可通過下調CD8+T細胞百分率而影響荷瘤小鼠的免疫功能。

細胞因子(Cytokine)是一類由活化的免疫細胞和相關基質細胞分泌，能作用于分泌細胞本身或其他細胞的生物活性物質，可參與機體的多種免疫調節(jié)，激發(fā)宿主對腫瘤的免疫反應，并可直接抑制惡性腫瘤的生長，在機體抗腫瘤免疫中具有重要意義[11，12]。TNF-α 是反映機體免疫功能的重要指標，產(chǎn)生于巨噬細胞和淋巴細胞，在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用[13]。IL-2是細胞免疫應答所必需的細胞因子，通過多種途徑發(fā)揮免疫調節(jié)作用[14，15]。IL-2主要由抗原激活的T細胞(主要是CD4+T亞群)產(chǎn)生，可促進細胞毒T細胞(CTL)增殖與分化，激活巨噬細胞和NK細胞。近幾年來，IL-2還作為一種免疫制劑，在臨床上用于治療黑色素瘤，取得了一定效果;TNF-α及IL-2二者具有協(xié)同抗腫瘤效應[16]。結果顯示，EPO沒有顯著影響荷瘤小鼠血清中TNF-α含量，但EPO處理組小鼠血清中IL-2水平與鹽水處理組相比明顯增高。表明EPO有可能通過促進免疫細胞分泌細胞因子IL-2，以改善機體免疫功能，從而提高機體對腫瘤的特異性免疫應答。

綜上所述，黑色素瘤可引起小鼠外周血RBC、Hb、Hct水平和免疫功能的下降，應用EPO在改善荷瘤小鼠貧血狀態(tài)的同時，又可通過改變血清中細胞因子的含量和血中T淋巴細胞亞群的比例來增強荷瘤小鼠的免疫功能。

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