長春新堿對人成骨肉瘤MG63細胞的增殖抑制和凋亡促進作用及其機制

劉國雄，婁 楠，王 洋，吳元成，黃嵐峰

（1.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳518109；2.深圳市人民醫(yī)院；3.吉林大學第二醫(yī)院）

骨肉瘤為青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，惡性程度高，進展快，預后差，增加了臨床治療的難度。對骨肉瘤化療藥物的研究，近年來取得了一定的進展［1－2］，但仍有相當數(shù)量的患者對藥物不夠敏感或用后很快產(chǎn)生耐藥性，預后不佳，而與此同時，現(xiàn)今所用的骨肉瘤相關(guān)藥物均有很強的副作用，這就使大劑量的藥物治療變得難以接受。于是目前迫切需要尋求療效更好的、副作用又小的化學治療藥物。長春新堿在應用于一些惡性腫瘤的治療，如白血病等，均取得了很好的療效［3］，但在長期應用于骨肉瘤這類惡性腫瘤方面，還鮮見系統(tǒng)的報道。本文應用骨肉瘤MG63細胞作為體外培養(yǎng)的實驗模型，較為系統(tǒng)地研究了長春新堿對細胞抑制增殖及促凋亡的效應；分析了長春新堿對細胞內(nèi)caspase 9及c－myc基因表達的影響，闡明其作用的分子機理，為指導治療骨肉瘤這類惡性腫瘤的臨床治療，提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 MG63細胞來源于ATCC。Hoechest 33342及CCK－8細胞活性檢測試劑盒源自碧云天生物技術(shù)研究所，Total RNA提取試劑源自Invitrogen公司，RNase free DNase I源自Promega，RT試劑盒源自TaKaRa，PCR引物由TaKa－Ra合成，實時PCR試劑（Sybe－Green）購自ABI公司，長春新堿源自哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和長春新堿處理 細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的H－DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、飽和濕度、37℃條件下于恒溫孵育箱中進行培養(yǎng)。將處于指數(shù)增長期的細胞接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，而后分別加入配制好的不同濃度的長春新堿（0、5、10、20、50、100μg·L－1），繼續(xù)培養(yǎng)24h后，開始收集細胞，進行檢測。

1.3 細胞生長曲線測定 取指數(shù)生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化計數(shù)后接種96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μl細胞懸液（1×103個細胞／孔），按照實驗分組分別進行標記，每組設6個平行孔。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，24h取出96孔板，在待測孔中加入10μl的CCK－8試劑，37℃孵育2h，測定490nm處吸光度，依據(jù)結(jié)果并繪制細胞生長曲線。

1.4 細胞形態(tài)觀察 收集細胞于EP管中，用4℃預冷的PBS緩沖液清洗3次，將2mol·L－1的Hoechest33342分別加入經(jīng)不同濃度長春新堿處理過的細胞，于37℃孵育30min，再用PBS緩沖液清洗3次，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Realtime RT－PCR檢測基因表達水平 應用Trizol Reagent提取不同濃度長春新堿處理過的細胞總RNA，用RNase free DNase I處理相應的RNA，并用RT試劑盒將相應的RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，以上操作均參考相關(guān)商品說明書。PCR引物序列：內(nèi)參 RPL－13上游引物，5’－CGA GTT GGC TGG AAG TAC C－3’；下游引物，CTT CTG GCC TGT TTC CGT AG－3’。caspase9上游引物，5’－GCG ACC TGA CTG CCA AGA AA－3’；下游引物，5’－TCA CAA TCT TCT CGA CCG TTA CA－3’。c－myc上游引物，5’－ACA ACC GAA AAT GCA CCA GC－3’；下游引物，5’－GTC GTT TCC GCA ACA AGT CC－3’。應用Sybe－Green反應體系進行PCR反應；反應體積為25μl。PCR反應程序為：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min；95℃、15s，60 ℃、30s，95℃、15s，40個循環(huán)。PCR反應產(chǎn)物的特異性均經(jīng)其融解曲線證實。通過實驗得到的各濃度實驗組的Ct值，與各濃度內(nèi)參RPL－13的Ct值進行比較，兩者的差值即為該實驗組的△Ct值，即實驗組△Ct值＝實驗加藥組Ct值－內(nèi)參加藥組Ct值。同理對照組△Ct值＝實驗對照組Ct值－內(nèi)參對照組Ct值。通過實驗組△Ct值與對照組△Ct值的比較，得出實驗組各濃度的△△Ct值＝實驗組△Ct值－對照組△Ct值。最后通過2（－△△Ct）來定量基因表達的改變。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗法進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 長春新堿減低MG63細胞的增殖率 長春新堿濃度為1、2、5、10、20、50和100μg·L－1作用于MG63細胞24h后對細胞的影響。其中長春新堿濃度為10μg·L－1時即可顯著抑制MG63的細胞增殖（P＜0.05），呈明確的劑量－效應關(guān)系，即抑制作用隨著藥物劑量的增加更明顯。

圖1 長春新堿減低MG63細胞的增殖率

2.2 長春新堿促進MG63的細胞凋亡 為反映長春新堿對細胞凋亡的作用，我們用Hoechest33342染色不同濃度處理過的MG63細胞，對照組細胞核呈均勻的淡藍色，存活細胞占絕大多數(shù)，而凋亡細胞數(shù)量極少；在長春新堿作用下，出現(xiàn)一些散在分布的致密濃染物質(zhì)，這些物質(zhì)顏色發(fā)亮而體積較小，此為蓄積大量Hoechest染料的已經(jīng)出現(xiàn)凋亡核濃縮現(xiàn)象的MG63細胞（如圖2所示）。

2.3 長春新堿作用影響相關(guān)基因的表達 經(jīng)過10和50μg·L－1長春新堿處理后，細胞內(nèi)c－myc的mRNA表達量顯著下調(diào)（P＜0.05），分別減低為對照組的（48.11±15.12）%和（35.84±5.97）%，呈明顯的濃度依賴關(guān)系；caspase9mRNA表達量顯著上調(diào)（P＜0.05），分別為對照組的3.46±1.24倍和16.85±2.02倍，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。表明長春新堿是通過下調(diào)c－myc基因表達，上調(diào)caspase9基因表達抑制MG63細胞增殖和促進凋亡的。

圖2 長春新堿作用后凋亡細胞的形態(tài)學改變（×100）

圖3 長春新堿顯著下調(diào)細胞內(nèi)c－myc及顯著上調(diào)caspase9的mRNA表達水平

3 討論

長春新堿是作用于細胞周期的一種特異性藥物。通常在細胞周期的S期，同微管蛋白進行結(jié)合，進而干擾了紡錘體的生成，阻斷了細胞周期進程，從而抑制腫瘤細胞增殖。長春新堿在其它方面也有顯著的作用，例如它還可以影響細胞核酸或蛋白質(zhì)代謝功能，進而抑制細胞增殖，誘導多種惡性腫瘤細胞發(fā)生凋亡［5－9］。

本研究深入討論了長春新堿作用于骨肉瘤MG63細胞，進而產(chǎn)生的一系列抑制增殖及促進凋亡的作用，及其相關(guān)的分子機理。結(jié)果證實低劑量（10μg·L－1）的長春新堿即可顯著抑制該細胞的增殖并促進其發(fā)生凋亡。該劑量遠低于長春新堿可以引發(fā)的機體中毒劑量（2mg·kg－1），這也就提示我們，長春新堿作為治療骨肉瘤這一類惡性腫瘤的新型化療藥物，具有廣闊研究和應用的價值。有研究［10－11］顯示：長春新堿當與其他藥物聯(lián)合應用時可增加MG63細胞對其他化療藥物的敏感性等，這些研究結(jié)果都可以支持本研究得出的結(jié)論。目前臨床治療骨肉瘤常用的化療藥物有單獨或聯(lián)合應用氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、順鉑（CDP）、異環(huán)磷酰胺（IFO）等一些藥物。但也有相關(guān)研究［12－13］顯示，這些藥物長期大劑量應用對于心臟、肝、腎等重要器官有較強的毒副作用，并且應用這些藥物化療后多會出現(xiàn)多藥耐藥的病例。

細胞增殖是指細胞以分裂的方式產(chǎn)生新的個體或新的細胞，用來對抗衰老和死亡細胞的過程。機體細胞的正常增殖是按照需要被嚴格調(diào)控的。一旦細胞增殖失去調(diào)控則會引起相應的腫瘤發(fā)生。細胞增殖受到各種分子信號調(diào)控，其中c－myc是一種可使細胞無限增殖的基因，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［13－15］。本研究結(jié)果顯示：濃度為10μg·L－1長春新堿作用下就可以顯著抑制MG63的細胞增殖（P＜0.05），并且呈明確的劑量－效應關(guān)系，即抑制作用隨著藥物劑量的增加更明顯；且在10和50μg·L－1長春新堿作用下，MG63細胞內(nèi)c－myc mRNA表達量顯著減少（P＜0.05），分別為對照組的（48.11±15.12）%和（35.84±5.97）%，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。表明：長春新堿可以有效下調(diào)MG63細胞內(nèi)c－myc mRNA表達量，是其致細胞抑制的主要原因。而c－myc可以導致多種腫瘤的發(fā)生，長春新堿可顯著下調(diào)其mRNA表達水平，提示長春新堿的抗腫瘤機制之一是通過抑制細胞內(nèi)c－myc的表達的途徑來完成的。

細胞凋亡是機體為調(diào)控自身的生長發(fā)育，維護其內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，由自身基因控制的細胞主動死亡過程。細胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細胞的重要機制。細胞凋亡可以發(fā)生細胞核的濃縮、染色體DNA被以核小體為單位而片段化，核固縮，以致最終形成凋亡小體，但并不釋放溶酶體，引起周圍細胞發(fā)生溶解。Caspase9在促進細胞凋亡的過程中起到了重要作用［16］。本研究的結(jié)果還顯示：在長春新堿作用下，出現(xiàn)一些散在分布的致密濃染物質(zhì)，這些物質(zhì)顏色發(fā)亮而體積較小，此為蓄積大量Hoechest染料的已經(jīng)出現(xiàn)凋亡核濃縮現(xiàn)象的MG63細胞；caspase9mRNA表達量顯著上調(diào)（P＜0.05），分別為對照組的3.46±1.24倍和16.85±2.02倍，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。所以，長春新堿可以有效上調(diào)MG63細胞內(nèi)caspase9mRNA表達量，是其促進細胞凋亡的主要原因。鑒于caspase9的促細胞凋亡作用，長春新堿可顯著上調(diào)其mRNA表達水平，提示長春新堿的抗腫瘤的另一作用機制是上調(diào)細胞內(nèi)caspase9的表達。

綜上所述，長春新堿從較低濃度（10μg·L－1）開始就能抑制骨肉瘤MG63細胞增殖，且遠低于其引起機體中毒劑量，這些都提示長春新堿作為治療骨肉瘤這類惡性腫瘤的化療藥物具有較高的研究和應用價值；而其抑制細胞增殖的作用機制是通過下調(diào)c－myc mRNA表達水平，也是長春新堿的抗腫瘤作用機制之一。在較低濃度（10μg·L－1）長春新堿作用下即可引起細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的凋亡細胞；而其引起細胞凋亡的作用機制是通過上調(diào)細胞內(nèi)caspase9mRNA表達水平，這也是長春新堿的抗腫瘤作用的另一機制。

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