Th17細(xì)胞與重癥肌無力發(fā)病及臨床嚴(yán)重度相關(guān)性研究

王中魁 魏東寧 王衛(wèi) 陳玉萍

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種T細(xì)胞輔助、抗體介導(dǎo)、補體參與的以神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙為特征的自身免疫性疾病，MG發(fā)病與乙酰膽堿受體自身抗體（anti－acetylcholine receptor autoantibodies，AChR－Ab）介導(dǎo)的體液免疫密切相關(guān)［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞參與MG發(fā)病。輔助性T細(xì)胞17（T helper type 17 cells，Th17細(xì)胞）是近年新發(fā)現(xiàn)的功能性CD4＋T輔助細(xì)胞亞群，可特異性表達(dá)促炎因子IL－17［2］，活化的 Th17細(xì)胞分泌IL－17A、IL－17F、IL－21、IL－22和TNF－α等細(xì)胞因子，通過誘發(fā)其他炎性因子、趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞促進(jìn)炎性反應(yīng)［3－4］。近年來研究證實Th17細(xì)胞參與多發(fā)性硬化、炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病發(fā)?。?－6］，而Th17細(xì)胞在 MG發(fā)病機制中的作用仍有爭議。本研究根據(jù)胸腺病理進(jìn)行分組，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測MG患者外周血Th17細(xì)胞比例，采用實時定量 RT－PCR（realtime reverse trancription polymerase chain reaction，Realtime RT－PCR）方法定量測定Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL－17、IL－1β、IL－6，IL－23、RORγ mRNA 轉(zhuǎn) 錄 水 平，采 用ELISA 檢測IL－17、IL－1β、IL－6和IL－23表達(dá)，并分析患者外周血Th17細(xì)胞比例與MG病情嚴(yán)重程度評分間的關(guān)系，以探討Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在MG發(fā)病機制中的作用。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 選擇2010－09－2011－12期間309醫(yī)院重癥肌無力中心治療的確診MG患者102例。MG根據(jù)典型的臨床癥狀、新斯的明試驗陽性或神經(jīng)重復(fù)電刺激遞減試驗陽性確診［7］。入組患者均行胸腺瘤／胸腺切除術(shù)＋脂肪清掃術(shù)。根據(jù)胸腺病理結(jié)果分為MG伴胸腺瘤組（MG with thymoma，TM）、MG 伴胸腺增生（MG with thymic hyperplasia，TH）、MG 正常胸腺組 （MG with normal thymus，NT）3組。健康對照組（healthy controls，HC）選擇309醫(yī)院體檢中心健康體檢志愿者32例，均無近期感染或自身免疫病史。各組之間性別、年齡間無統(tǒng)計學(xué)差異。各組臨床資料見表1。

表1 各組MG患者臨床資料

1.2 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞刺激劑佛波酯（PMA）、離子霉素（Ionomycin）購自Sigma公司，莫奈霉素購自Enzo公司；PC5標(biāo)記抗人CD4單克隆抗體購自Beckman coulter公司，抗人CD4抗體購自BD Biosciences公司，抗人IL－17A抗體及ELISA試劑盒購自eBioscience公司；細(xì)胞膜破膜固定試劑購自BD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司；乙酰膽堿受體抗體試劑盒購自R＆D公司。PCR引物（表2）由上海博亞生物技術(shù)公司合成；流式細(xì)胞儀購自Beckman Coulter FC500公司，Rotor gene 3000實時定量PCR儀來自Corbett公司。

1.3 方法

1.3.1 Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平及表達(dá)水平檢測:在MG患者病情穩(wěn)定期且未接受免疫抑制治療及胸腺切除術(shù)前，抽取15mL靜脈血。使用密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs）制成懸液。使用RNA抽提試劑盒分離mRNA，獲得的總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，－80℃保存。以實時定量RT－PCR檢測 MG 患者 PBMCs IL－17、IL－1β、IL－6、IL－23和ROR－γmRNA轉(zhuǎn)錄水平，以β－actin為內(nèi)參基因，以細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與內(nèi)參基因表達(dá)量的比值作為其mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平。使用ELISA 試劑盒檢測 MG 患者血清IL－17、IL－1β、IL－6、IL－23和 TGF－β細(xì)胞因子表達(dá)水平。

表2 Realtime RT PCR引物序列

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMCs Th17細(xì)胞比例:將PBMCs密度調(diào)整至2×106／L。使用PMA 100 ng、離子霉素1μg和莫奈霉素2μmol／L共刺激5 h。以抗人CD4抗體染色15min，使用破膜試劑溶解細(xì)胞膜，使用抗人IL－17A抗體胞內(nèi)染色20 min。使用流式細(xì)胞儀檢測Th17／CD4＋T細(xì)胞比例。

1.3.3 MG臨床嚴(yán)重程度評估:在MG患者未接受免疫抑制治療及胸腺切除術(shù)前，使用美國重癥肌無力協(xié)會QMG評分評價患者病情，并分析血清Th17細(xì)胞比例與QMG評分之間的相關(guān)性。使用抗人AChR－Ab試劑盒（檢測范圍20～500pmol／L）測定MG患者血清AChR－Ab水平。分析MG患者血清Th17細(xì)胞比例與血清AChR－Ab水平間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SSPS 19.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用ANOVA進(jìn)行多組間比較及組間兩兩比較，使用Pearson回歸分析進(jìn)行兩因素相關(guān)回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 外周血Th17細(xì)胞比例 MG伴胸腺瘤患者外周血Th17細(xì)胞比例升高。MG伴胸腺瘤組〔（1.57±0.56）%〕顯 著 高 于 對 照 組 〔（0.94±0.32）%，P＝0.031〕，對照組與 MG伴胸腺增生組〔（1.35±0.36）%〕及 MG 正常胸腺組〔（1.09±0.52）%〕之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄量MG伴胸腺瘤患者IL－17A、IL－1β、IL－6、RORγ及IL－23mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平高于對照組（表3）。

2.3 MG伴胸腺瘤患者血清細(xì)胞因子表達(dá) MG伴胸腺瘤患者血清細(xì)胞因子IL－17A、IL－1β及IL－23表達(dá)水平高于對照組（表3）。各組IL－6表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表3 Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)及其mRNA相對表達(dá)量

2.4 MG伴胸腺瘤組外周血Th17細(xì)胞比例與QMG評分相關(guān)性 使用QMG評分評價MG患者臨床嚴(yán)重程度，MG伴胸腺瘤組QMG評分與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r＝0.74，P＝0.034），MG伴胸腺增生組（r＝0.51，P＝0.087）、MG正常胸腺組（r＝0.14，P＝0.41）Th17細(xì)胞比例與QMG評分不相關(guān)。

2.5 MG患者外周血Th17細(xì)胞比例與血清AChR－Ab水平相關(guān)性分析 102例MG患者中72例外周血AChR－Ab結(jié)果為陽性（＞20pmol／L），32例對照組均為陰性。各組AChR－Ab水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。MG患者血清AChRAb水平與Th17細(xì)胞比例（%）呈正相關(guān)（r＝0.81，P＝0.026）。

3 討論

MG是一種以胸腺為靶器官的自身免疫性疾病［1］，近期研究證實細(xì)胞免疫缺陷參與 MG發(fā)?。?］。Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的功能性CD4＋T輔助細(xì)胞亞群，特異性表達(dá)IL－17。人Th17細(xì)胞是在TGF－β和IL－1β共同誘導(dǎo)下由初始T細(xì)胞分化而來［9－11］。Th17細(xì)胞對于維持機體免疫耐受有重要調(diào)節(jié)作用，可參與多種自身免疫性疾病發(fā)?。?－6］。Th17 細(xì) 胞 及 其 相 關(guān) 細(xì) 胞因 子IL－17、IL－1β、IL－6和IL－23在 MG發(fā)病機制中的作用仍有爭議。

IL－17是Th17細(xì)胞特征性標(biāo)記因子，研究證實IL－17是一種促炎細(xì)胞因子，可上調(diào)趨化因子表達(dá)，趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞至炎性反應(yīng)部位，增強組織炎性反應(yīng)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，MG伴胸腺瘤患者IL17mRNA和血清IL－17水平均顯著增高，而正常胸腺 MG患者未發(fā)現(xiàn)類似改變，提示Th17細(xì)胞可能與胸腺瘤引起的免疫功能損傷緊密相關(guān)。細(xì)胞因子IL－23可調(diào)控IL－17表達(dá)，促進(jìn)Th17細(xì)胞存活［9，13］。IL－1β可誘導(dǎo)人 ROR 表達(dá)，后者對于Th17的分化和發(fā)育具有重要意義［14］。因此，IL－1β和IL－23對于 Th17細(xì)胞的成熟和自穩(wěn)有重要意義。本研究結(jié)果顯示，MG伴胸腺瘤組組 RORγ、IL－23和IL－1β表達(dá)上調(diào)，提示IL－23和IL－1β可能是參與人Th17細(xì)胞誘導(dǎo)和自穩(wěn)的主要因素。

在實驗性自身免疫性重癥肌無力（experimen－tal autoimmune myasthenia gravis，EAMG）模型中，Th17細(xì)胞比例明顯增高，IL－17表達(dá)亦明顯增加［15］，然而臨床研究顯示 MG患者外周血Th17細(xì)胞比例與健康對照無明顯差異［16］。本研究結(jié)果顯示伴胸腺瘤MG患者外周血Th17細(xì)胞比例顯著升高，非胸腺瘤MG患者外周血Th17細(xì)胞比例與健康對照相比無明顯差異，提示Th17細(xì)胞比例變化與胸腺瘤密切相關(guān)。最近一項研究證實，與眼肌型MG和健康對照相比，全身型MG患者外周血Th17細(xì)胞比例顯著升高，且血清AChR－Ab水平與Th17細(xì)胞比例有相關(guān)性；不過入組該研究的25例MG患者，僅2例存在胸腺病變（2例IL－17水平均明顯升高）［17］，因此該研究尚需臨床觀察更多伴胸腺異常的MG患者進(jìn)一步驗證。以往曾有研究證實伴發(fā)胸腺瘤MG體內(nèi)自身反應(yīng)性T細(xì)胞增多，可輔助 B 細(xì)胞產(chǎn)生自身反應(yīng)性抗體［18－19］。本研究中伴胸腺病變的MG樣本量較大，結(jié)果顯示血清AChR－Ab與外周血Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r＝0.81，P＝0.026），由此推測Th17細(xì)胞可能通過影響B(tài)細(xì)胞生成自身免疫性抗體在MG發(fā)病中發(fā)揮作用，與上述研究結(jié)果相似。進(jìn)一步分析血清Th17細(xì)胞比例與MG患者臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度評分——QMG評分之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，胸腺瘤組中QMG評分與Th17細(xì)胞比例正相關(guān)，提示Th17細(xì)胞僅與MG伴胸腺瘤病情嚴(yán)重程度相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果顯示，MG患者外周血Th17細(xì)胞與AChR－Ab水平呈正相關(guān)，MG伴胸腺瘤患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)目和IL－17表達(dá)上調(diào)且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。因此Th17細(xì)胞數(shù)目上調(diào)可能導(dǎo)致免疫耐受失衡，引發(fā)MG等自身免疫性疾病發(fā)病。本研究胸腺瘤各亞組樣本量小，各亞組間Th17細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯差異，需要通過后期研究進(jìn)一步探索不同病理類型胸腺瘤患者Th17細(xì)胞差異，并需要進(jìn)一步研究Th17細(xì)胞在MG發(fā)病中的具體機制和信號通路，這對于MG的診斷和治療可能會有重要意義。

［1］Meriggioli MN，Sanders DB.Autoimmune myasthenia gravis:emerging clinical and biological heterogeneity［J］.Lancet Neurol，2009，8（5）:475－490.

［2］Spolski R，Leonard WJ.Cytokine mediators of Th17function［J］.Eur J Immunol，2009，39（3）:658－661.

［3］Ouyang W，Kolls JK，Zheng Y.The biological functions of T helper 17cell effector cytokines in inflammation［J］.Immuni－ty，2008，28（4）:454－567.

［4］Dong C.Regulation and pro－inflammatory function of interleukin－17family cytokine［J］.Immunol Rev，2008，226:80－86.

［5］Pène J，Chevalier S，Preisser L，et al.Chronically inflamed human tissues are infiltrated by highly differentiated Th17 lymphocytes［J］.J Immunol，2008，180（11）:7423－7430.

［6］Duerr RH，Taylor KD，Brant SR，et al.A genomewide association study identifies IL23Ras an inflammatory bowel disease gene［J］.Science，2006，314（5804）:1461－1463.

［7］Pal J，Rozsa C，Komoly S，et al.Clinical and biological heterogeneity of autoimmune myasthenia gravis［J］.J Neuroimmunol，2011，231（1－2）:43－54.

［8］Luther C，Poeschel S，Varga M，et al.Decreased frequency of intrathymic regulatory T cells in patients with myastheniaassociated thymoma［J］.J Neuroimmunol，2005，164（1－2）:124－128.

［9］Veldhoen M，Hocking RJ，Atkins CJ，et al.TGF beta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL－17－producing T cells［J］.Immunity，2006，24（2）:179－189.

［10］Mangan PR，Harrington LE，O′Quinn DB，et al.Transforming growth factor－beta induces development of the T（H）17 lineage［J］.Nature，441（7090）:231－234.

［11］Bettelli E，Carrier Y，Gao W，et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells［J］.Nature，441（7090）:235－238.

［12］Weaver CT，Hatton RD，Mangan PR，et al.IL－17family cytokines and the expanding diversity of effector T cell lineages［J］.Annu Rev Immunol，2007，25:821－852.

［13］Aggarwal S，Ghilardi N，Xie MH，et al.Interleukin－23promotes a distinct CD4Tcell activation state characterized by the production of interleukin－17［J］.J Biol Chem，2003，278（3）:1910－1914.

［14］Acosta－Rodriguez EV，Napolitani G，Lanzavecchia A，et al.Interleukins 1beta and 6but not transforming growth factorbeta are essential for the differentiation of interleukin 17－producing human T helper cells［J］.Nat Immunol，2007，8（9）:942－949.

［15］Mu L，Sun B，Kong Q，et al.Disequilibrium of T helper type 1，2and 17cells and regulatory T cells during the development of experimental autoimmune myasthenia gravis［J］.Immunology，2009，128（1Suppl）:e826－836.

［16］Masuda M，Matsumoto M，Tanaka S，et al.Clinical implication of peripheral CD4＋CD25＋regulatory T cells and Th17 cells in myasthenia gravis patients［J］.J Neuroimmunol，2010，225（1－2）:123－131.

［17］Roche JC，Capablo JL，Larrad L，et al.Increased serum interleukin－17levels in patients with myasthenia gravis［J］.Muscle Nerve，2011，44（2）:278－280.

［18］Str?bel P，Rosenwald A，Beyersdorf N，et al.Selective loss of regulatory T cells in thymomas［J］.Ann Neurol，2004，56（6）:901－904.

［19］Kadota Y，Okumura M，Miyoshi S，et al.Altered T cell development in human thymoma is related to impairment of MHC class II transactivator expression induced by interferongamma（IFN－gamma）［J］.Clin Exp Immunol，2000，121（1）:59－68.