血清儲存條件和凍融過程對AQP4抗體測定結(jié)果的影響

李海峰 郝洪軍 謝琰臣

視神經(jīng)脊髓炎（NMO）是一種致殘性自身免疫疾病。血清水通道蛋白4（AQP4）抗體有助于對NMO與多發(fā)性硬化（MS）進行鑒別，這對臨床診治這兩種疾病具有重要意義，因為兩者的預(yù)后以及療法不同。血清中的AQP4抗體與NMO發(fā)病直接有關(guān)［1］，且其血清水平與疾病的嚴重程度相關(guān)［2］。臨床實踐中，只有一些檢測中心進行該抗體的檢查，其他相關(guān)單位需要在常溫或冰凍的情況下運輸標本到檢測中心；臨床研究中，標本可能多次被檢測，可能經(jīng)過凍融過程。Jarius等［3］于2011年9月在Clin Chem Lab Med雜志發(fā)表論文首次報道儲存條件和凍融過程對血清AQP4抗體水平的影響。

該作者采用常規(guī)方法從1例NMO患者抽血送檢，常溫（18℃）下以1800r／min離心8min。將患者的血清標本分成多個小份，同時分別儲存在不同條件下（表1）。然后采用英國RSR公司生產(chǎn)的商品化ELISA試劑盒進行雙孔檢測，其抗原為重組的全長人類AQP4。結(jié)果顯示AQP4抗體水平在試劑盒標準曲線的范圍內(nèi)（5～160AU／mL）。無論儲存溫度為－80℃、4℃還是常溫，以及凍融次數(shù)多少（無凍融、1、2、3或5次凍融），結(jié)果均無統(tǒng)計學差異，平均變異系數(shù)（CV）為2.66%，提示不同條件下儲存標本的ELISA檢測結(jié)果之間具有高度可重復(fù)性。該研究提示至少在8d內(nèi)于室溫或4℃儲存或反復(fù)凍融對檢測結(jié)果無影響。但作者提出，該份血清中AQP4抗體水平較高，并不處于正常參考值低限，也不是溶血標本的血清，還需要進一步使用抗體水平較低或溶血標本研究不同儲存條件是否會影響所檢測到的AQP4水平。該作者同時指出，總體來講，抗體相對穩(wěn)定而一些蛋白成分抗原的穩(wěn)定性較差，如果需要同時檢查其他蛋白成分，如細胞因子，則應(yīng)該儲存在－80℃或干冰運輸，并避免凍融過程。

Jarius長期從事NMO患者的自身抗體研究，截止2011年9月底在MEDLINE檢索可以查到其以第一作者或參與研究的抗體檢測文章31篇，涉及AQP4抗體檢測方法學建立、AQP4抗體在NMO病譜疾病中的意義、血清和腦脊液中AQP4抗體檢測的意義以及多種副腫瘤綜合征相關(guān)抗體等，且其抗體檢測多數(shù)采用ELISA方法。基于此，可以確認其具有豐富的ELISA檢測經(jīng)驗，所得結(jié)果可靠，其平行孔的CV最大者僅為6.61%，也說明其檢測時加樣的準確性很好?；跍蚀_的檢測，以及整體CV很小，可以確認儲存條件和反復(fù)凍融對AQP4抗體檢測結(jié)果無影響。

對該研究應(yīng)予注意:（1）ELISA方法檢測蛋白或抗體可能因被測物的不同而使標本處理過程對檢測結(jié)果的可靠性產(chǎn)生不同影響，最終影響研究的科學性；（2）標本中如果抗體水平過高，可能會超出標準曲線的上限，對于接近上限的檢測值，需要考慮稀釋標本后重新檢測，以確保測出其真實水平，這是ELISA的基本原理決定的；（3）兩個平行孔檢測的結(jié)果按照統(tǒng)計學理論亦可進行標準差和CV運算，但其結(jié)果的可靠性相較于通過多個（如6～8個）平行孔結(jié)果計算所得結(jié)果要差；不過，這個研究總體和各處理組的平行孔結(jié)果的變異系數(shù)均很小且接近，仍提示其結(jié)果具有高度可重復(fù)性。

表1 NMO患者血清樣本經(jīng)不同方法處理后其ELISA檢測結(jié)果

其他以ELISA方法檢測的被測物水平受標本處理、儲存條件和凍融影響的研究（各研究采用符合各種被測物檢測原理的商品化ELISA試劑盒）包括:腦脊液中的磷酸化神經(jīng)絲重鏈水平不受反復(fù)凍融影響［4］；血清中的麻疹、風疹和水痘病毒抗體水平也不受反復(fù)凍融影響［5］；血漿和血清白細胞介素－6水平不受抗凝劑、抽血后延遲處理標本或反復(fù)凍融的影響［6］；腦脊液中基質(zhì)金屬蛋白酶－2水平受室溫和4℃儲存的影響而下降，但不受反復(fù)凍融的影響［7］；延遲處理標本、室溫儲存可以使血管內(nèi)皮生長因子水平顯著增高，但不受－80℃儲存2年以及反復(fù)凍融的影響［8］；反復(fù)凍融使血漿中的von Willebrand因子水平顯著下降［9］?？梢姴煌粶y物在不同的標本處理、儲存和凍融條件下檢測到的水平并不都能反映留取標本時被測物的水平。如果考慮到被測物的生物活性，還需要對其活性是否受到上述因素影響進行評價。這樣得到的檢測值才能更好反映其在體內(nèi)的水平和活性。

抗AQP4抗體以及前述被測物均為診斷、病情嚴重程度和療效監(jiān)測的生物學標志物。準確檢測這些被測物的水平和活性，能夠幫助臨床決策，也能夠更好完成臨床科研。尤其是在被測物被轉(zhuǎn)運到檢測中心或保存多年后進行臨床研究時，研究者不能忽略其標本處理方法和儲存方法而簡單認為檢測值就是該被測物的實際值。確信檢測值前要明確檢測方法的穩(wěn)定性和可靠性，同時也要充分考慮到未來研究會將檢測的被測物，查閱相關(guān)方法學文獻，選擇適合多種被測物檢測的標本處理和儲存方法。前述方法學文獻多發(fā)表在臨床檢驗雜志上，而這也正是臨床醫(yī)生進行研究時容易忽略的，應(yīng)予注意。

［1］Jarius S，Wildemann B.AQP4antibodies in neuromyelitis optica:diagnostic and pathogenetic relevance［J］.Nat Rev Neurol 2010，6:383－392.

［2］Jarius S，Aboul－Enein F，Waters P，et al.Antibody to aquaporin－4in the long－term course of neuromyelitis optica［J］.Brain，2008，131:3072－3080.

［3 ］Jarius S，Wildemann B.Effect of storage conditions and freeze／thaw cycles on aquaporin－4antibody（NMO－IgG）serum levels［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49:2121－2122.

［4］Petzold A，Keir G，Green AJ，et al.A specific ELISA for measuring neurofilament heavy chain phosphoforms［J］.J Immunol Methods，2003，278:179－190.

［5］Pinsky NA，Huddleston JM，Jacobson RM，et al.Effect of multiple freeze－thaw cycles on detection of measles，mumps，and rubella virus antibodies［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2003，10:19－21.

［6］Knudsen LS，Christensen IJ，Lottenburger T，et al.Pre－analytical and biological variability in circulating interleukin 6in healthy subjects and patients with rheumatoid arthritis［J］.Biomarkers，2008，13:59－78.

［7］Sulik A，Wojtkowska M，Oldak E.Preanalytical factors affecting the stability of matrix metalloproteinase－2concentrations in cerebrospinal fluid［J］.Clin Chim Acta，2008，392:73－75.

［8 ］Hetland ML，Christensen IJ，Lottenburger T，et al.Circulating VEGF as a biological marker in patients with rheumatoid arthritis？Preanalytical and biological variability in healthy persons and in patients［J］.Dis Markers，2008，24:1－10.

［9］Smith BW，Strakova J，King JL，et al.Validated sandwich ELISA for the quantification of von Willebrand factor in rabbit plasma［J］.Biomark Insights，2010，5:119－127.