TLR4蛋白在顳葉癲癇大鼠及患者腦組織中表達(dá)的改變及意義

劉希金 殷亞萍 楊志勇 孫圣剛 鄧學(xué)軍

顳葉癲癇海馬區(qū)存在明顯的神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生和突觸重建，被認(rèn)為是導(dǎo)致顳葉癲癇的病理生理基礎(chǔ)。在癲癇動物模型及顳葉癲癇患者腦組織中可見小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化、神經(jīng)元丟失，同時癲癇發(fā)作時，腦組織中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、環(huán)氧化酶－1（cydooxygenase－1，COX－1）、環(huán)氧化酶－2 （cydooxygenase－2，COX－2）、白細(xì)胞介素－1（interleukin－1，IL－1）等炎性反應(yīng)因子表達(dá)亦相應(yīng)增高，這些證據(jù)表明炎性反應(yīng)介質(zhì)可能在癲癇的發(fā)生中重要作用［1－3］。

Toll樣受體4（TLR4）信號通路是一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族，是介導(dǎo)免疫反應(yīng)的主要信號通路，其主要分布于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等免疫反應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上［4］。TLR4受體蛋白與相應(yīng)的配體結(jié)合后，誘發(fā)下游信號核因子κB（nuclear factor κB，NFκB）的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生［5－6］。但是有關(guān)TLR4信號通路在癲癇發(fā)病機(jī)制作用中的研究相對較少［7－8］。

本研究通過檢測大鼠顳葉癲癇模型海馬及顳葉癲癇患者顳葉內(nèi)側(cè)腦組織中TLR4蛋白的表達(dá)變化，旨在探討TLR4信號通路在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 動物及人腦組織 健康成年雄性SD大鼠100只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，體質(zhì)量200～230g，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境（24～25℃，50%～60%濕度，12h晝夜交替）下飼養(yǎng)。該實驗獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物倫理學(xué)批準(zhǔn)。人腦組織樣本由協(xié)和醫(yī)院腦外科提供，患者知情并簽署倫理學(xué)文件。共取得26份人腦組織，其中20份來自20例癲癇患者，且均有多種抗癲癇藥物的暴露史，但癲癇控制欠佳，另6份來自6例腦外傷且無癲癇及癲癇藥物暴露史的患者作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型建立與分組:隨機(jī)選取10只大鼠作為鹽水對照組，其余大鼠建立癲癇模型。給予大鼠腹腔注射氯化鋰（按體質(zhì)量127mg／kg），17.5h后按體質(zhì)量1mg／kg給予腹腔注射阿托品（購自中國上海禾豐制藥有限公司），0.5h后按體質(zhì)量15mg／kg給予腹腔注射毛果蕓香堿（購自美國Sigma－Aldrich公司）。癲癇發(fā)作等級參照Racine標(biāo)準(zhǔn)［9］，觀察0.5h后若未達(dá)到4級及以上發(fā)作，則按體質(zhì)量15mg／kg重復(fù)注射毛果蕓香堿1次，最大劑量不超過60mg／kg，若至最大劑量仍無癲癇發(fā)作（無急性發(fā)作組）則停止注射。成功誘發(fā)急性發(fā)作的8只大鼠于急性期（3d內(nèi)）處死（急性發(fā)作組），剩余大鼠按體質(zhì)量10mg／kg給予腹腔注射地西泮（購自中國天津藥業(yè)焦作有限公司）以終止急性發(fā)作，然后單籠飼養(yǎng)并觀察，經(jīng)（33±6.5）d潛伏期后，部分進(jìn)入慢性自發(fā)性發(fā)作期（慢性自發(fā)性發(fā)作組），其余則為無慢性自發(fā)性發(fā)作組。

1.2.2 腦電圖（EEG）監(jiān)測:各組大鼠分別行EEG監(jiān)測，每只大鼠分別監(jiān)測2h。將大鼠麻醉固定，用細(xì)針分別插入雙側(cè)耳（參考電極A）、前額中央（frontal pole1，F(xiàn)P1；frontal pole2，F(xiàn)P2）、耳 下（temporal 1，T1；temporal 2，T2）、枕部（occipital 1，O1；occipital 2，O2），另一端接入腦電信號處理系統(tǒng)［10］。分析各組大鼠在相同時間（2h）內(nèi)棘波（spike－wave discharges，SWDs）的數(shù)量［11］，以棘波發(fā)放數(shù)目評估大鼠腦電情況。

1.2.3 免疫組化:大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉，打開胸腔，經(jīng)心尖部插入灌流針，以生理鹽水沖盡血液，待灌流液清亮，用多聚甲醛灌流液固定，斷頭取腦并置多聚甲醛液中浸泡，石蠟包埋，切片。將石蠟切片置于65℃烘箱中烘烤2h后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5min。切片置于乙二胺四乙酸（EDTA）緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10min低火至沸，自然冷卻后以PBS洗3次，每次5min。切片放入3%（體積分?jǐn)?shù)）過氧化氫溶液，室溫下孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS洗3次，每次5min，甩干后5%（質(zhì)量濃度）牛血清白蛋白（BSA）封閉20min以封閉電荷，去除BSA液，每張切片加入50μL稀釋的TLR4抗體（編號:ab22408，批號:76B357.1，購自美國Abcam公司）覆蓋組織，4℃過夜，用PBS洗3次，每次5min，去除PBS液，每張切片加100μL二抗（武漢谷歌公司），4℃孵育50min，PBS洗3次，每次5min，去除PBS液，每張切片加50～100μL新鮮配制二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，顯微鏡控制顯色，顯色完全后，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%（體積分?jǐn)?shù)）鹽酸酒精分化（1s），自來水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗，切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。每張切片于相同光度及相同放大倍數(shù)（×400）下拍照，采用圖像分析軟件6.0（Image－Pro Plus 6.0）分析每張圖片的平均吸光度，以平均吸光度表示TLR4蛋白的表達(dá)水平。

人腦組織的處理:經(jīng)手術(shù)切除病灶取樣后，于多聚甲醛液中浸泡24h，待標(biāo)本充分固定后，石蠟包埋，切片。余操作同上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)輸入SPSS V12.0數(shù)據(jù)處理軟件（Chicago，IL，USA），計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差（AVONA）分析，兩兩比較采用SNK檢驗；人腦數(shù)據(jù)采用t檢驗。以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察 大鼠腹腔注射毛果蕓香堿10～30min后，63只出現(xiàn)癲癇急性發(fā)作，表現(xiàn)為流涎、結(jié)膜充血等反應(yīng)，伴有點頭、眨眼、咀嚼及濕狗樣震顫，最后出現(xiàn)站立、跌倒或旋轉(zhuǎn)，持續(xù)數(shù)分鐘至半小時不等。發(fā)作后1h給予腹腔注射地西泮終止發(fā)作，其中8只未能有效終止發(fā)作而死亡。隨機(jī)選取8只成功誘發(fā)癲癇急性發(fā)作的大鼠為急性發(fā)作組。17只誘發(fā)癲癇急性發(fā)作的大鼠經(jīng)潛伏期后進(jìn)入慢性自發(fā)性發(fā)作期，另30只大鼠在視頻監(jiān)測觀察中未出現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作。潛伏期內(nèi)大鼠食欲下降、消瘦，慢性自發(fā)性發(fā)作期可見大鼠間斷出現(xiàn)全身抽搐、旋轉(zhuǎn)，每次持續(xù)數(shù)秒鐘至數(shù)分鐘不等。

圖1 各組大鼠EEG情況（T1導(dǎo)聯(lián)）

2.2 EEG檢測 在急性發(fā)作組及慢性自發(fā)性發(fā)作組大鼠均可見明顯SWDs發(fā)放（圖1），明顯高于其他3組（P＜0.05），且慢性自發(fā)性發(fā)作組SWDs數(shù)目高于急性發(fā)作組（P＜0.05）；鹽水對照組未見SWDs，無急性發(fā)作組及無慢性自發(fā)性發(fā)作組偶見SWDs發(fā)放，且無急性發(fā)作組和無慢性自發(fā)性發(fā)作組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），鹽水對照組和其他4組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠EEG SWDs數(shù)目和CA3區(qū)TLR4蛋白水平 （，n＝8）

表1 各組大鼠EEG SWDs數(shù)目和CA3區(qū)TLR4蛋白水平 （，n＝8）

注:A:鹽水對照組；B:無急性發(fā)作組；C:急性發(fā)作組；D:無慢性自發(fā)性發(fā)作組；E:慢性自發(fā)性發(fā)作組；與A組比較，＊P＜0.05；分別與B、D組比較，＃P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05；

組別 SWDs數(shù)量（個數(shù)） TLR4蛋白水平（A值）A 0.00±0.00 0.07858±0.01098 B 255.25±36.78＊ 0.08438±0.01422 C 723.00±94.11＊＃ 0.13810±0.01264＊＃D 322.75±47.55＊ 0.08672±0.00701 E 1046.25±110.41＊?！?0.19650±0.01386＊＃△F值138.8384 105.862 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 大鼠免疫組化結(jié)果 鹽水對照組、無急性發(fā)作組、急性發(fā)作組、無慢性自發(fā)性發(fā)作組和慢性自發(fā)性發(fā)作組大鼠海馬組織CA3區(qū)均有TLR4蛋白的表達(dá)（圖2）。鹽水對照組、無急性發(fā)作組、無慢性自發(fā)性發(fā)作組大鼠海馬組織CA3區(qū)有少量TLR4蛋白表達(dá)，3組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；TLR4蛋白在急性發(fā)作組及慢性自發(fā)性發(fā)作組的表達(dá)均高于其他3組（P＜0.05）；慢性自發(fā)性發(fā)作組高于急性發(fā)作組（P＜0.05）（表1）。

2.4 人腦免疫組化結(jié)果 TLR4蛋白在顳葉癲癇患者腦組織切片表達(dá)水平（0.79100±0.01750）高于對照組（0.15700±0.02588）（P＜0.05）（圖3）。

3 討論

癲癇是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，大多數(shù)患者經(jīng)正規(guī)治療后可有效控制癲癇發(fā)作，但有一部分患者未能有效控制仍可見頻繁發(fā)作，臨床上稱為難治性癲癇，該部分絕大多數(shù)患者為顳葉癲癇［12］。癲癇的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說，但是沒有一種確切的機(jī)制能全面闡述癲癇［13］。

圖2 各組大鼠CA3區(qū)TLR4蛋白表達(dá)（箭頭所示，免疫組織化學(xué)×400）A:鹽水對照組；B:無急性發(fā)作組；C:急性發(fā)作組；D:無慢性自發(fā)性發(fā)作組；E:慢性自發(fā)性發(fā)作組圖3 TLR4蛋白在人腦組織切片中的表達(dá)（箭頭所示，免疫組織化學(xué)×400）A:對照組；B癲癇組

近年來，國內(nèi)外研究報道，炎性反應(yīng)因子參與了癲癇的發(fā)病過程［1，14－15］。TLR4受體在免疫反應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上廣泛表達(dá)。TLR4受體活化后，誘導(dǎo)下游的NF－κB進(jìn)入細(xì)胞核，參與一系列的反應(yīng)，促使炎性反應(yīng)因子的釋放和免疫反應(yīng)細(xì)胞的增生與活化，而活化的免疫細(xì)胞釋放更多的炎性反應(yīng)因子，同時增生活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能缺陷，調(diào)節(jié)興奮性氨基酸的功能降低，使神經(jīng)元興奮性增加，可能是導(dǎo)致癲癇的反復(fù)發(fā)作的病理機(jī)制。但是，有關(guān)于TLR4信號通路在癲癇發(fā)病中的研究報道較少［7－8］。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，是易導(dǎo)致癲癇發(fā)生的敏感部位，這是顳葉癲癇發(fā)病的解剖學(xué)基礎(chǔ)。以往的動物實驗中，動物的分組往往忽略了無癲癇急性發(fā)作和無慢性自發(fā)性發(fā)作大鼠的實驗數(shù)據(jù)并鮮有EEG數(shù)據(jù)，而這些實驗數(shù)據(jù)可能對闡述疾病有著一定的意義。EEG可以為癲癇嚴(yán)重程度的評估提供比較客觀的證據(jù)。增加無癲癇急性發(fā)作組，可表明研究指標(biāo)與癲癇發(fā)作的因果關(guān)系，驗證該指標(biāo)是癲癇急性發(fā)作的因還是癲癇急性發(fā)作的果；癲癇作為一種較為特殊的疾病，有的患者經(jīng)歷一次癇性發(fā)作以后可能再無發(fā)作，有的患者在經(jīng)歷一次發(fā)作后會有更多的癇性發(fā)作，臨床研究中很難獲得只發(fā)作一次而再無發(fā)作患者的腦組織樣本，而有癲癇急性發(fā)作但無慢性自發(fā)性發(fā)作的大鼠與僅有一次癇性發(fā)作的患者有類似的特點。因此，在實驗研究中增加這兩個動物分組也許能夠更加詳盡體現(xiàn)研究指標(biāo)的變化趨勢，揭示研究指標(biāo)在不同時點發(fā)揮的作用，闡述其在顳葉癲癇的不同時期表達(dá)改變的意義。本實驗通過建立動物顳葉癲癇實驗?zāi)Ｐ筒⑤o以EEG和視頻觀察，細(xì)化了動物模型分組，增加了無癲癇急性發(fā)作和有癲癇急性發(fā)作但無慢性自發(fā)性發(fā)作這兩個動物分組，以求更加有效地闡述TLR4信號通路在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。該研究結(jié)果顯示，顳葉癲癇大鼠模型TLR4蛋白主要表達(dá)于CA1、CA3、齒狀回和丘腦，在皮質(zhì)也有一定的表達(dá)；TLR4蛋白在急性發(fā)作組和慢性自發(fā)性發(fā)作組表達(dá)增加，并且慢性自發(fā)性發(fā)作組高于急性發(fā)作組，而在其他各組則無統(tǒng)計學(xué)差異；并且TLR4蛋白的表達(dá)水平與EEG具有類似的變化趨勢，提示TLR4信號通路在動物顳葉癲癇點燃后即有一定程度的表達(dá)上調(diào)，而急性發(fā)作期后的過度表達(dá)可能是癲癇反復(fù)發(fā)作的原因。

雖然動物模型可以在一定程度上模擬人類顳葉癲癇，但動物實驗仍有一定的局限性，不能完全模擬人類顳葉癲癇疾病。因此，該研究同時檢測了TLR4蛋白在人腦組織中的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)在癲癇患者腦組織切片中TLR4蛋白的表達(dá)也高于對照組。由于采取健康人腦組織樣本不符合倫理學(xué)，故該研究以腦外傷后切除病灶周圍的正常腦組織作為對照。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，TLR4蛋白的過度表達(dá)可能是癲癇發(fā)病的結(jié)果，而并非癲癇發(fā)生的始動點。對于癲癇急性發(fā)作后TLR4信號通路表達(dá)上調(diào)是否是導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作的原因，有待于更深入的研究。

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