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    TLR4蛋白在顳葉癲癇大鼠及患者腦組織中表達(dá)的改變及意義

    2013-11-23 11:50:56劉希金殷亞萍楊志勇孫圣剛鄧學(xué)軍
    關(guān)鍵詞:顳葉自發(fā)性切片

    劉希金 殷亞萍 楊志勇 孫圣剛 鄧學(xué)軍

    顳葉癲癇海馬區(qū)存在明顯的神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生和突觸重建,被認(rèn)為是導(dǎo)致顳葉癲癇的病理生理基礎(chǔ)。在癲癇動物模型及顳葉癲癇患者腦組織中可見小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化、神經(jīng)元丟失,同時癲癇發(fā)作時,腦組織中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、環(huán)氧化酶-1(cydooxygenase-1,COX-1)、環(huán)氧化酶-2 (cydooxygenase-2,COX-2)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)等炎性反應(yīng)因子表達(dá)亦相應(yīng)增高,這些證據(jù)表明炎性反應(yīng)介質(zhì)可能在癲癇的發(fā)生中重要作用[1-3]。

    Toll樣受體4(TLR4)信號通路是一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族,是介導(dǎo)免疫反應(yīng)的主要信號通路,其主要分布于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等免疫反應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上[4]。TLR4受體蛋白與相應(yīng)的配體結(jié)合后,誘發(fā)下游信號核因子κB(nuclear factor κB,NFκB)的活化,進(jìn)而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生[5-6]。但是有關(guān)TLR4信號通路在癲癇發(fā)病機(jī)制作用中的研究相對較少[7-8]。

    本研究通過檢測大鼠顳葉癲癇模型海馬及顳葉癲癇患者顳葉內(nèi)側(cè)腦組織中TLR4蛋白的表達(dá)變化,旨在探討TLR4信號通路在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

    1 材料和方法

    1.1 動物及人腦組織 健康成年雄性SD大鼠100只,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,體質(zhì)量200~230g,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(24~25℃,50%~60%濕度,12h晝夜交替)下飼養(yǎng)。該實驗獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物倫理學(xué)批準(zhǔn)。人腦組織樣本由協(xié)和醫(yī)院腦外科提供,患者知情并簽署倫理學(xué)文件。共取得26份人腦組織,其中20份來自20例癲癇患者,且均有多種抗癲癇藥物的暴露史,但癲癇控制欠佳,另6份來自6例腦外傷且無癲癇及癲癇藥物暴露史的患者作為對照組。

    1.2 方法

    1.2.1 癲癇模型建立與分組:隨機(jī)選取10只大鼠作為鹽水對照組,其余大鼠建立癲癇模型。給予大鼠腹腔注射氯化鋰(按體質(zhì)量127mg/kg),17.5h后按體質(zhì)量1mg/kg給予腹腔注射阿托品(購自中國上海禾豐制藥有限公司),0.5h后按體質(zhì)量15mg/kg給予腹腔注射毛果蕓香堿(購自美國Sigma-Aldrich公司)。癲癇發(fā)作等級參照Racine標(biāo)準(zhǔn)[9],觀察0.5h后若未達(dá)到4級及以上發(fā)作,則按體質(zhì)量15mg/kg重復(fù)注射毛果蕓香堿1次,最大劑量不超過60mg/kg,若至最大劑量仍無癲癇發(fā)作(無急性發(fā)作組)則停止注射。成功誘發(fā)急性發(fā)作的8只大鼠于急性期(3d內(nèi))處死(急性發(fā)作組),剩余大鼠按體質(zhì)量10mg/kg給予腹腔注射地西泮(購自中國天津藥業(yè)焦作有限公司)以終止急性發(fā)作,然后單籠飼養(yǎng)并觀察,經(jīng)(33±6.5)d潛伏期后,部分進(jìn)入慢性自發(fā)性發(fā)作期(慢性自發(fā)性發(fā)作組),其余則為無慢性自發(fā)性發(fā)作組。

    1.2.2 腦電圖(EEG)監(jiān)測:各組大鼠分別行EEG監(jiān)測,每只大鼠分別監(jiān)測2h。將大鼠麻醉固定,用細(xì)針分別插入雙側(cè)耳(參考電極A)、前額中央(frontal pole1,F(xiàn)P1;frontal pole2,F(xiàn)P2)、耳 下(temporal 1,T1;temporal 2,T2)、枕部(occipital 1,O1;occipital 2,O2),另一端接入腦電信號處理系統(tǒng)[10]。分析各組大鼠在相同時間(2h)內(nèi)棘波(spike-wave discharges,SWDs)的數(shù)量[11],以棘波發(fā)放數(shù)目評估大鼠腦電情況。

    1.2.3 免疫組化:大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉,打開胸腔,經(jīng)心尖部插入灌流針,以生理鹽水沖盡血液,待灌流液清亮,用多聚甲醛灌流液固定,斷頭取腦并置多聚甲醛液中浸泡,石蠟包埋,切片。將石蠟切片置于65℃烘箱中烘烤2h后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,每次5min。切片置于乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液中微波修復(fù),中火至沸后斷電,間隔10min低火至沸,自然冷卻后以PBS洗3次,每次5min。切片放入3%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫溶液,室溫下孵育10min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,用PBS洗3次,每次5min,甩干后5%(質(zhì)量濃度)牛血清白蛋白(BSA)封閉20min以封閉電荷,去除BSA液,每張切片加入50μL稀釋的TLR4抗體(編號:ab22408,批號:76B357.1,購自美國Abcam公司)覆蓋組織,4℃過夜,用PBS洗3次,每次5min,去除PBS液,每張切片加100μL二抗(武漢谷歌公司),4℃孵育50min,PBS洗3次,每次5min,去除PBS液,每張切片加50~100μL新鮮配制二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液,顯微鏡控制顯色,顯色完全后,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染,1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸酒精分化(1s),自來水沖洗,氨水返藍(lán),流水沖洗,切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固。每張切片于相同光度及相同放大倍數(shù)(×400)下拍照,采用圖像分析軟件6.0(Image-Pro Plus 6.0)分析每張圖片的平均吸光度,以平均吸光度表示TLR4蛋白的表達(dá)水平。

    人腦組織的處理:經(jīng)手術(shù)切除病灶取樣后,于多聚甲醛液中浸泡24h,待標(biāo)本充分固定后,石蠟包埋,切片。余操作同上。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)輸入SPSS V12.0數(shù)據(jù)處理軟件(Chicago,IL,USA),計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差(AVONA)分析,兩兩比較采用SNK檢驗;人腦數(shù)據(jù)采用t檢驗。以P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠行為學(xué)觀察 大鼠腹腔注射毛果蕓香堿10~30min后,63只出現(xiàn)癲癇急性發(fā)作,表現(xiàn)為流涎、結(jié)膜充血等反應(yīng),伴有點頭、眨眼、咀嚼及濕狗樣震顫,最后出現(xiàn)站立、跌倒或旋轉(zhuǎn),持續(xù)數(shù)分鐘至半小時不等。發(fā)作后1h給予腹腔注射地西泮終止發(fā)作,其中8只未能有效終止發(fā)作而死亡。隨機(jī)選取8只成功誘發(fā)癲癇急性發(fā)作的大鼠為急性發(fā)作組。17只誘發(fā)癲癇急性發(fā)作的大鼠經(jīng)潛伏期后進(jìn)入慢性自發(fā)性發(fā)作期,另30只大鼠在視頻監(jiān)測觀察中未出現(xiàn)慢性自發(fā)性發(fā)作。潛伏期內(nèi)大鼠食欲下降、消瘦,慢性自發(fā)性發(fā)作期可見大鼠間斷出現(xiàn)全身抽搐、旋轉(zhuǎn),每次持續(xù)數(shù)秒鐘至數(shù)分鐘不等。

    圖1 各組大鼠EEG情況(T1導(dǎo)聯(lián))

    2.2 EEG檢測 在急性發(fā)作組及慢性自發(fā)性發(fā)作組大鼠均可見明顯SWDs發(fā)放(圖1),明顯高于其他3組(P<0.05),且慢性自發(fā)性發(fā)作組SWDs數(shù)目高于急性發(fā)作組(P<0.05);鹽水對照組未見SWDs,無急性發(fā)作組及無慢性自發(fā)性發(fā)作組偶見SWDs發(fā)放,且無急性發(fā)作組和無慢性自發(fā)性發(fā)作組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),鹽水對照組和其他4組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

    表1 各組大鼠EEG SWDs數(shù)目和CA3區(qū)TLR4蛋白水平 (,n=8)

    表1 各組大鼠EEG SWDs數(shù)目和CA3區(qū)TLR4蛋白水平 (,n=8)

    注:A:鹽水對照組;B:無急性發(fā)作組;C:急性發(fā)作組;D:無慢性自發(fā)性發(fā)作組;E:慢性自發(fā)性發(fā)作組;與A組比較,*P<0.05;分別與B、D組比較,#P<0.05;與C組比較,△P<0.05;

    組別 SWDs數(shù)量(個數(shù)) TLR4蛋白水平(A值)A 0.00±0.00 0.07858±0.01098 B 255.25±36.78* 0.08438±0.01422 C 723.00±94.11*# 0.13810±0.01264*#D 322.75±47.55* 0.08672±0.00701 E 1046.25±110.41*?!?0.19650±0.01386*#△F值138.8384 105.862 P值 <0.001 <0.001

    2.3 大鼠免疫組化結(jié)果 鹽水對照組、無急性發(fā)作組、急性發(fā)作組、無慢性自發(fā)性發(fā)作組和慢性自發(fā)性發(fā)作組大鼠海馬組織CA3區(qū)均有TLR4蛋白的表達(dá)(圖2)。鹽水對照組、無急性發(fā)作組、無慢性自發(fā)性發(fā)作組大鼠海馬組織CA3區(qū)有少量TLR4蛋白表達(dá),3組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);TLR4蛋白在急性發(fā)作組及慢性自發(fā)性發(fā)作組的表達(dá)均高于其他3組(P<0.05);慢性自發(fā)性發(fā)作組高于急性發(fā)作組(P<0.05)(表1)。

    2.4 人腦免疫組化結(jié)果 TLR4蛋白在顳葉癲癇患者腦組織切片表達(dá)水平(0.79100±0.01750)高于對照組(0.15700±0.02588)(P<0.05)(圖3)。

    3 討論

    癲癇是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,大多數(shù)患者經(jīng)正規(guī)治療后可有效控制癲癇發(fā)作,但有一部分患者未能有效控制仍可見頻繁發(fā)作,臨床上稱為難治性癲癇,該部分絕大多數(shù)患者為顳葉癲癇[12]。癲癇的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說,但是沒有一種確切的機(jī)制能全面闡述癲癇[13]。

    圖2 各組大鼠CA3區(qū)TLR4蛋白表達(dá)(箭頭所示,免疫組織化學(xué)×400)A:鹽水對照組;B:無急性發(fā)作組;C:急性發(fā)作組;D:無慢性自發(fā)性發(fā)作組;E:慢性自發(fā)性發(fā)作組圖3 TLR4蛋白在人腦組織切片中的表達(dá)(箭頭所示,免疫組織化學(xué)×400)A:對照組;B癲癇組

    近年來,國內(nèi)外研究報道,炎性反應(yīng)因子參與了癲癇的發(fā)病過程[1,14-15]。TLR4受體在免疫反應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上廣泛表達(dá)。TLR4受體活化后,誘導(dǎo)下游的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,參與一系列的反應(yīng),促使炎性反應(yīng)因子的釋放和免疫反應(yīng)細(xì)胞的增生與活化,而活化的免疫細(xì)胞釋放更多的炎性反應(yīng)因子,同時增生活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能缺陷,調(diào)節(jié)興奮性氨基酸的功能降低,使神經(jīng)元興奮性增加,可能是導(dǎo)致癲癇的反復(fù)發(fā)作的病理機(jī)制。但是,有關(guān)于TLR4信號通路在癲癇發(fā)病中的研究報道較少[7-8]。

    海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分,是易導(dǎo)致癲癇發(fā)生的敏感部位,這是顳葉癲癇發(fā)病的解剖學(xué)基礎(chǔ)。以往的動物實驗中,動物的分組往往忽略了無癲癇急性發(fā)作和無慢性自發(fā)性發(fā)作大鼠的實驗數(shù)據(jù)并鮮有EEG數(shù)據(jù),而這些實驗數(shù)據(jù)可能對闡述疾病有著一定的意義。EEG可以為癲癇嚴(yán)重程度的評估提供比較客觀的證據(jù)。增加無癲癇急性發(fā)作組,可表明研究指標(biāo)與癲癇發(fā)作的因果關(guān)系,驗證該指標(biāo)是癲癇急性發(fā)作的因還是癲癇急性發(fā)作的果;癲癇作為一種較為特殊的疾病,有的患者經(jīng)歷一次癇性發(fā)作以后可能再無發(fā)作,有的患者在經(jīng)歷一次發(fā)作后會有更多的癇性發(fā)作,臨床研究中很難獲得只發(fā)作一次而再無發(fā)作患者的腦組織樣本,而有癲癇急性發(fā)作但無慢性自發(fā)性發(fā)作的大鼠與僅有一次癇性發(fā)作的患者有類似的特點。因此,在實驗研究中增加這兩個動物分組也許能夠更加詳盡體現(xiàn)研究指標(biāo)的變化趨勢,揭示研究指標(biāo)在不同時點發(fā)揮的作用,闡述其在顳葉癲癇的不同時期表達(dá)改變的意義。本實驗通過建立動物顳葉癲癇實驗?zāi)P筒⑤o以EEG和視頻觀察,細(xì)化了動物模型分組,增加了無癲癇急性發(fā)作和有癲癇急性發(fā)作但無慢性自發(fā)性發(fā)作這兩個動物分組,以求更加有效地闡述TLR4信號通路在顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。該研究結(jié)果顯示,顳葉癲癇大鼠模型TLR4蛋白主要表達(dá)于CA1、CA3、齒狀回和丘腦,在皮質(zhì)也有一定的表達(dá);TLR4蛋白在急性發(fā)作組和慢性自發(fā)性發(fā)作組表達(dá)增加,并且慢性自發(fā)性發(fā)作組高于急性發(fā)作組,而在其他各組則無統(tǒng)計學(xué)差異;并且TLR4蛋白的表達(dá)水平與EEG具有類似的變化趨勢,提示TLR4信號通路在動物顳葉癲癇點燃后即有一定程度的表達(dá)上調(diào),而急性發(fā)作期后的過度表達(dá)可能是癲癇反復(fù)發(fā)作的原因。

    雖然動物模型可以在一定程度上模擬人類顳葉癲癇,但動物實驗仍有一定的局限性,不能完全模擬人類顳葉癲癇疾病。因此,該研究同時檢測了TLR4蛋白在人腦組織中的表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)在癲癇患者腦組織切片中TLR4蛋白的表達(dá)也高于對照組。由于采取健康人腦組織樣本不符合倫理學(xué),故該研究以腦外傷后切除病灶周圍的正常腦組織作為對照。

    綜上所述,該研究結(jié)果表明,TLR4蛋白的過度表達(dá)可能是癲癇發(fā)病的結(jié)果,而并非癲癇發(fā)生的始動點。對于癲癇急性發(fā)作后TLR4信號通路表達(dá)上調(diào)是否是導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作的原因,有待于更深入的研究。

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