甲潑尼龍減輕水通道蛋白4抗體對星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的毒性

張潔 劉亞坤 王彥永 任士卿

視神經(jīng)脊髓炎（NMO）是一種主要侵犯視神經(jīng)和脊髓的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘性疾病。隨著對其特異性自身抗體即水通道蛋白4（aquaporin－4，AQP4）抗體研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其不僅是NMO鑒別多發(fā)性硬化（MS）的特異標(biāo)志物，而且在NMO發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。AQP4抗體和中樞神經(jīng)系統(tǒng)血－腦脊液屏障周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上的AQP4結(jié)合激活補體，對星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生補體依賴性細(xì)胞毒性作用，破壞血－腦脊液屏障和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，導(dǎo)致NMO的發(fā)生［1］。目前大劑量甲潑尼龍是治療急性NMO的首選方法，但缺乏循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)。臨床研究僅見小樣本病例報道，認(rèn)為甲潑尼龍可能通過免疫抑制作用、抗炎、減輕細(xì)胞水腫等發(fā)揮其治療作用［2］，有關(guān)其對AQP4抗體誘導(dǎo)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的研究尚未見報道。本實驗觀察AQP4陽性血清對體外培養(yǎng)大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的毒性作用，以及甲潑尼龍預(yù)處理對星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的影響，旨在為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑:細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM，購自GIBCO公司）、胎牛血清（四季青公司）、多聚甲醛（天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心）、Hoechst33258（Sigma公司）、抗微管相關(guān)蛋白－2（MAP－2，購自Sigma公司）、抗神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP，購自NeoMarkers）、異硫氰酸熒光素（FITC，購自Sigma公司）、甲波尼龍（購自Pfizer公司）。

1.1.2 AQP4陽性血清:收集作者醫(yī)院就診的NMO患者3例，NMO診斷采用 Wingerchuck診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。AQP4抗體測定采用細(xì)胞間接免疫熒光分析法，其AQP4抗體滴度分別為1∶10、1∶320和1∶1000，作為抗體陽性組；5名健康體檢者血清作為對照組。所有血清抗可溶性抗原（ENA）抗體檢測陰性。均取晨空腹靜脈血，高速離心機離心（800 g）3min，血清置－80℃冰箱備用。本研究得到作者醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng):選取出生48h以內(nèi)的Wistar大鼠新生鼠6只，于無菌狀態(tài)下取出雙側(cè)大腦皮質(zhì)，剝離腦膜后，將剪碎的皮質(zhì)組織用0.25%（質(zhì)量濃度）胰蛋白酶消化20min，加入20%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，用火焰拋光的玻璃吸管反復(fù)吹打，制備成單細(xì)胞懸液，以50 g離心5min，去除上清，加入3～4mL培養(yǎng)液，再次吸管吹打后細(xì)胞篩過濾，將細(xì)胞接種到多聚賴氨酸包被的6孔板中，置5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后換液，培養(yǎng)4d的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組:原代大鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)4d后隨機分為6組:（1）對照組:按10%體積比例加入對照組血清；（2）不同AQP4抗體陽性血清組:按10%體積比例分別加入1∶10、1∶320和1∶1000滴度的AQP4抗體陽性血清，共3個亞組；（3）單獨甲潑尼龍組:預(yù)先4h加入0.8μmol／mL甲潑尼龍10μL，隨后按10%體積加入對照組血清；（4）甲潑尼龍＋1∶1000血清組:預(yù)先加入0.8μmol／mL甲潑尼龍10μL，4h后按10%體積比例加入1∶1000滴度AQP4抗體陽性血清。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6h后對培養(yǎng)細(xì)胞固定并行細(xì)胞免疫熒光染色。各組均重復(fù)測定3次。

1.2.3 免疫熒光染色:將準(zhǔn)備行免疫熒光染色的細(xì)胞用0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3次；以4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛室溫下固定30min；含0.3%（體積分?jǐn)?shù)）Triton X－100的5%（體積分?jǐn)?shù)）山羊血清室溫下與細(xì)胞作用45～60min；加入兔抗 MAP－2（1∶100）或兔抗GFAP（1∶200）與細(xì)胞共同孵育，4℃過夜；加入FITC－羊抗兔IgG（1∶100）或FITC－羊抗鼠IgG（1∶100），37℃孵育45 min；為明確各種神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)，Hoechst33258（10 μg／mL）復(fù)染胞核；每步驟間均經(jīng)0.01mol／L PBS漂洗3次，每次5min。最后置于Nikon倒置熒光顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目，CCD（Nikon Digital Camera DXM－1200F）采樣。每次行免疫熒光染色時，均設(shè)一張陰性對照，即一抗由PBS代替，其余染色過程相同。

1.2.4 細(xì)胞計數(shù)方法:在倒置熒光顯微鏡下隨機選擇10個不同的視野，使用NIS－Elements BR 3.0軟件采樣，應(yīng)用Image Pro－Plus軟件進(jìn)行計數(shù)MAP－2陽性神經(jīng)元數(shù)和GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，并通過計數(shù)Hochest33258標(biāo)記明確細(xì)胞總數(shù)，然后計算不同神經(jīng)細(xì)胞所占的比例。為保證采集圖像的質(zhì)量，每次實驗均根據(jù)陰性對照結(jié)果調(diào)節(jié)曝光時間。各組實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP4抗體陽性血清對原代培養(yǎng)鼠大腦皮層細(xì)胞形態(tài)的影響 對照組細(xì)胞外形清晰，突起粗壯；加入各種滴度的AQP4抗體陽性血清6h后均可見星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，突起減少、縮短及斷裂。神經(jīng)元細(xì)胞也出現(xiàn)突起減少、斷裂、長度不完整表現(xiàn)。單獨甲波尼龍?zhí)幚斫M并不引起明顯星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元形態(tài)的變化，而甲波尼龍＋1∶1000血清組能明顯減少這種形態(tài)改變，細(xì)胞損傷程度明顯減輕（圖1）。

圖1 大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)MAP－2和GFAP免疫熒光染色結(jié)果（×200）

2.2 AQP4抗體陽性血清對原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的影響 對照組、1∶10、1∶320和1∶1000滴度血清處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞比例分別為（52.22±3.75）%、（45.83±4.82）%、（35.77±5.91）%和（24.68±3.40）%；神經(jīng)元比例分別 為 （44.93±2.39）%、（39.00±4.33）%、（32.21±2.67）%和（23.35±2.65）%。各組間其星形膠質(zhì)細(xì)胞比例和神經(jīng)元比例有統(tǒng)計學(xué)差異（F值分別為48.09和71.41，均P＜0.01），組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.01）。

2.3 甲波尼龍對大鼠皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響 單獨甲波尼龍組和甲潑尼龍＋1∶1000血清組星形膠質(zhì)細(xì)胞比例分別為（44.52±3.71）%和（43.29±3.80）%；神經(jīng)元比例分別為（43.10±5.56）%和（42.11±5.94）%。與1∶1000滴度血清組比較，甲潑尼龍＋1∶1000血清組星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元數(shù)目明顯增多（均P＜0.01）。單獨甲波尼龍組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少（P＜0.01），而對神經(jīng)元數(shù)目無影響（P＞0.05）。

3 討論

AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的水通道蛋白，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)微血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突、神經(jīng)膠質(zhì)界膜和室管膜上［4］。體外單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)研究表明AQP4抗體和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的AQP4結(jié)合，并激活補體通路以補體依賴形式導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡［5］。AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞吸附AQP4抗體能減少AQP4抗體滴度和對星形膠質(zhì)細(xì)胞的損害［6］。這些研究均采用單純星形膠質(zhì)細(xì)胞或AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)。本研究使用原代大鼠大腦皮質(zhì)混合細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，AQP4抗體陽性血清不僅導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的減少，也可引起神經(jīng)元的丟失，類似于NMO的病理改變，提示這是一種相對理想的研究NMO發(fā)病機制的體外模型。

該研究采用不同滴度的AQP4抗體陽性血清處理原代胎鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，AQP4抗體滴度越高，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少越嚴(yán)重，表明AQP4抗體對星形膠質(zhì)細(xì)胞有滴度依賴性的神經(jīng)毒性作用。推測AQP4抗體滴度越高，則和AQP4結(jié)合越多，激活補體和中性粒細(xì)胞募集越嚴(yán)重，對星形膠質(zhì)細(xì)胞的損害越重。臨床研究也發(fā)現(xiàn)AQP4抗體滴度和NMO疾病嚴(yán)重度有關(guān)。首先疾病復(fù)發(fā)時AQP4抗體滴度明顯高于緩解期［7］；其次抗體滴度越高，視力損害、脊髓和腦部病變越嚴(yán)重，EDSS評分越高［8］；另外，免疫抑制治療緩解疾病癥狀的同時血清AQP4抗體滴度也下降［9］。因此，作者建議在臨床上定期檢測NMO患者血AQP4抗體滴度，及時調(diào)整免疫抑制劑的用量，盡快降低AQP4抗體滴度，可促進(jìn)NMO恢復(fù)和預(yù)防NMO復(fù)發(fā)。

本研究結(jié)果顯示，AQP4抗體也可導(dǎo)致不表達(dá)AQP4的神經(jīng)元數(shù)目減少，提示AQP4抗體間接導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。有關(guān)小鼠腦內(nèi)注射AQP4抗體和人補體的NMO動物模型研究表明，除早期出現(xiàn)AQP4和GFAP表達(dá)喪失、髓鞘破壞、軸索損傷外，尚出現(xiàn)神經(jīng)元延遲性壞死［1］。對星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)研究也表明AQP4抗體和星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4結(jié)合，通過谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性作用間接導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞損害［10］。細(xì)胞外谷氨酸含量增高對表達(dá)谷氨酸受體的神經(jīng)元也有明顯的興奮性毒性，推測神經(jīng)元損傷應(yīng)是AQP4抗體和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面AQP4結(jié)合后，通過限制谷氨酸攝入改變谷氨酸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，引起神經(jīng)元死亡。另外AQP4抗體和星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4結(jié)合，增加血－腦脊液屏障通透性，激活小膠質(zhì)細(xì)胞以及炎性反應(yīng)發(fā)生也可能發(fā)揮重要作用［11］。這也可部分解釋NMO患者病變主要波及灰質(zhì)和預(yù)后不良的原因。目前，NMO復(fù)發(fā)首選治療方法為大劑量甲潑尼龍沖擊療法，盡管并未得到循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)支持。甲潑尼龍作為一種抗炎和免疫抑制劑通過多種機制發(fā)揮其作用。甲潑尼龍能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)，阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞膜去極化，抑制炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和軸突生長等［12－13］。本研究結(jié)果顯示，盡管單獨甲波尼龍預(yù)處理對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定毒性作用，但甲波尼龍預(yù)處理能明顯減輕AQP4抗體對星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的毒性。甲潑尼龍通過何種機制發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用仍需進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明AQP4抗體在體外對大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元產(chǎn)生滴度依賴性的細(xì)胞毒性作用，甲波尼龍可以中和AQP4抗體對大鼠皮質(zhì)細(xì)胞的毒性，這為臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療NMO提供了一定的理論依據(jù)。

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