參麥合劑對(duì)兔干眼癥模型淚液分泌及眼表結(jié)構(gòu)的影響

叢晨陽 溫 瑩 畢宏生， 解孝鋒 郭大東 杜然然

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)山東，濟(jì)南，250012;2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院，濟(jì)南，250002;3山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所，濟(jì)南，250002)

干眼癥是由于淚液質(zhì)和量的異常引起淚膜的不穩(wěn)定和眼表損害，從而導(dǎo)致眼部不適。西醫(yī)以局部對(duì)癥治療為主，效果不顯著且存在副作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病是五臟六腑功能失調(diào)，或燥邪所傷致津液耗傷而產(chǎn)生。隨著中醫(yī)藥對(duì)干眼癥研究的不斷深入，通過辨證論治、專方驗(yàn)方、局部用藥、針刺、穴位按摩、中藥噴霧等治療均有良好的療效，臨床觀察結(jié)果顯示患者的各種癥狀、體征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)都有一定程度的改善，并且無西藥的不良反應(yīng)[1]。參麥合劑是根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，篩選出鬼針草、玄參、麥冬制成的配方顆粒，三藥合用有清熱養(yǎng)陰潤目的作用。本研究通過觀察參麥合劑顆粒劑灌胃對(duì)兔干眼癥模型淚液分泌及眼表結(jié)構(gòu)的影響，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康新西蘭大白兔30只(山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)室提供)，雌雄不限，體重2.1～2.5 kg。動(dòng)物的飼養(yǎng)及環(huán)境均遵循國際眼科與視覺科學(xué)研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 參麥合劑為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方，鬼針草、玄參、麥冬(1∶2∶2)三蒸水配制成濃度0.3 g/mL口服液(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司);苯扎氯胺(benzalkonium chloride，BAC)(Sigma)三蒸水配制成濃度0.1%溶液;Schirmer試驗(yàn)濾紙條(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司);熒光素鈉眼科檢測(cè)試紙(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司);硝酸纖維素膜(PALL);過碘酸－席夫(PAS)染色試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 30只新西蘭大白兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、藥物治療組，每組10只。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備 所有動(dòng)物選取右眼為實(shí)驗(yàn)眼滴用0.1%苯扎氯胺(BAC)4周，2次/d，建立干眼動(dòng)物模型[2]。4周后，檢查干眼模型兔，見角結(jié)膜外觀干燥，淚液量少，Schirmer試驗(yàn)值均＜10 mm/5 min(對(duì)照組均＞10 mm);淚膜破裂時(shí)間(break up time，BUT)均＜10 s;熒光素染色見角結(jié)膜點(diǎn)、片狀著色，即為模型制作成功[3]。

1.2.3 藥物配制和用法 參麥合劑(鬼針草、玄參、麥冬顆粒劑)稀釋液，濃度0.3 g/mL。藥物治療組在建立動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上給予參麥合劑灌胃干預(yù)，根據(jù)兔體重配比率(1 mL/kg)每日灌胃1次;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組同時(shí)灌胃等體積生理鹽水;空白對(duì)照組不做任何治療，其正常眼作為正常對(duì)照組。

1.3 標(biāo)本取材及檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由同一人檢查。檢查時(shí)間、地點(diǎn)、照明亮度及溫度相同。于給藥后第7，14，21，28 d，分別在裂隙燈下觀察兔角結(jié)膜外觀、熒光素染色、BUT;同時(shí)做Schirmer試驗(yàn)，結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查(CIC)。給藥后28 d，以空氣栓塞法處死動(dòng)物后，每組隨機(jī)取5只新西蘭兔剪取角膜和距角膜緣2 mm上方中央球結(jié)膜組織，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.3.1 Schirmer試驗(yàn) 鹽酸奧布卡因表面麻醉后1 min后，棉簽蘸干眼瞼周圍液體，將Schirmer試紙置于兔下方結(jié)膜囊的中、外三分之一交界處，其余部分懸垂于皮膚表面，閉眼，5 min后取出濾紙條，測(cè)濾紙條的浸濕長度。

1.3.2 BUT 將熒光素鈉眼科檢測(cè)試紙條放置在下瞼結(jié)膜囊片刻，使熒光素鈉均勻分布于眼表后維持眼瞼張開，在裂隙燈顯微鏡下用鈷藍(lán)光觀察，直至淚膜上出現(xiàn)第1個(gè)干燥斑，記錄從眼瞼張開到第1個(gè)干燥斑出現(xiàn)的時(shí)間，連續(xù)測(cè)量三次，取平均值并記錄。

1.3.3 結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查(CIC) 治療后第7，14，21，28 d各組分別行結(jié)膜印記細(xì)胞學(xué)檢查。將硝酸纖維素膜剪成3.5 mm×3.5 mm大小，以蒸餾水浸泡4h，烘干，備用。表面麻醉后分別將兩片硝酸纖維素膜粗糙面向下置于鼻上和顳上象限球結(jié)膜，持續(xù)按壓10秒印取表層上皮細(xì)胞。將濾膜置于95%乙醇中固定。過碘酸席夫試劑(PAS)染色。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)杯狀細(xì)胞，根據(jù)Nelson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行分級(jí)。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查:將剪下的角膜和結(jié)膜組織置于10%福爾馬林固定24 h。梯度脫水后，石蠟包埋和切片，HE染色，結(jié)膜加做PAS染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。同一時(shí)間點(diǎn)，各組Schirmer test值、BUT值比較均采用單因素方差分析法，并進(jìn)一步采用LSD－t檢驗(yàn)法兩兩比較。比較同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間的差異，則采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Schirmer試驗(yàn) 兔干眼癥模型Schirmer test值均＜10 mm。治療前空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和藥物治療組的 Schirmer test值分別為(8.40±0.76)mm、(8.60±0.77)mm、(8.49±0.65)mm，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.098，P=0.907)。治療第14 d，藥物治療組Schirmer test值為(12.07±0.84)mm，較用藥前明顯升高(t=－51.694，P=0.000)，較空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組亦明顯升高(F=26.742，P=0.000)，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.559，P＞0.05);用藥28 d后，藥物治療組 Schirmer test值為(16.01±1.33)mm，較治療前明顯延長(t=－28.161，P=0.000)，較空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組亦明顯延長(F=82.090，P=0.000)，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－1.758，P＞0.05)，見表1。

2.2 BUT 淚膜破裂時(shí)間均＜10 s。治療前空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和藥物治療組的BUT值分別為(8.95±1.30)s、(8.74 ±0.65)s及(8.29 ±1.12)s，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.550，P=0.583)。治療第14 d，藥物治療組BUT值為(10.57±1.40)s，較治療前明顯延長(t=－7.921，P=0.000)，較空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組亦明顯延長(F=3.977，P=0.031)，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.094，P＞0.05);用藥28 d后，藥物治療組BUT值為(14.27±1.82)s，較治療前明顯延長(t=－16.476，P=0.000)，較空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組亦明顯延長(F=29.706，P=0.000)，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－1.208，P＞0.05)(表2)。

表1 各組用藥后Schirmer test值的變化(mm)

表2 各組用藥后BUT值的變化(s)

2.3 熒光素鈉染色(FL) 干眼模型制作完成后，肉眼可見兔角結(jié)膜外觀干燥無光澤;熒光素染色見角結(jié)膜點(diǎn)、片狀著色。藥物治療組用藥7 d后，兔角結(jié)膜外觀干燥較用藥前略有好轉(zhuǎn)，淚液量少，但角結(jié)膜點(diǎn)、片狀著色較干眼癥組明顯好轉(zhuǎn):治療14 d后，角結(jié)膜干燥進(jìn)一步好轉(zhuǎn)，淚液量增加，角結(jié)膜點(diǎn)、片狀著色少;治療28 d后，角結(jié)膜外觀濕潤，淚液明顯增加，角結(jié)膜未見著色。

2.4 結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查(CIC) 干眼模型組與正常對(duì)照組之間杯狀細(xì)胞密度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥后，藥物治療組杯狀細(xì)胞密度逐漸增加，與給藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)杯狀細(xì)胞密度與給藥前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查采用目前公認(rèn)的Nelson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行分級(jí)。鱗狀上皮化生分為4個(gè)級(jí)別，0級(jí):正常;Ⅰ級(jí):輕度;Ⅱ級(jí):中度;Ⅲ級(jí):重度。正常兔眼Nelson分級(jí)為0級(jí)，干眼癥眼分級(jí)為Ⅱ級(jí)。給藥后，藥物治療組杯狀細(xì)胞密度逐漸增加，形態(tài)趨于正常?？瞻讓?duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)杯狀細(xì)胞密度和形態(tài)與給藥前無明顯差異(圖2)。

2.5 光鏡檢查 顯微鏡下可以看到，在正常結(jié)膜上皮由柱狀的上皮細(xì)胞層和3－4層立方細(xì)胞構(gòu)成，PAS陽性的杯狀細(xì)胞穿插其中(A)。在空白對(duì)照組(B)和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(C)中，結(jié)膜變薄，立方細(xì)胞層消失，PAS陽性的杯狀細(xì)胞顯著減少。藥物治療組(D)與正常兔眼對(duì)比結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量未見明顯差異，但結(jié)膜上皮層數(shù)較正常兔眼減少。

圖1 正常對(duì)照組及藥物治療組杯狀細(xì)胞密度(*P ＜0.05，＊＊P＜0.01)

圖2 (A)正常兔眼，Nelson分級(jí)為0級(jí)。(B)治療前，Nelson分級(jí)為Ⅱ級(jí)。(C)治療14天后，Nelson分級(jí)為I級(jí)。P(D)治療28天后，Nelson分級(jí)為0級(jí)。(×200)

圖3 結(jié)膜石蠟切片(×200)

3 討論

國際干眼工作組于2007年定義干眼為:多種因素所致的一種淚液和眼表疾病，包括眼表不適癥狀，視力變化和淚膜不穩(wěn)定并且有潛在眼表損害，伴隨淚液滲透壓升高和眼表炎癥反應(yīng)[5]。西醫(yī)對(duì)干眼癥發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥是干眼癥發(fā)病機(jī)制中最關(guān)鍵的因素[6]。性激素分泌失衡[7]、神經(jīng)功能障礙[8]和細(xì)胞凋亡[9]也共同參與干眼癥的發(fā)病過程。淚膜的持續(xù)異常可損傷眼表正常的修復(fù)或防御機(jī)制，導(dǎo)致眼表和淚腺處于一種慢性炎癥狀態(tài)。中醫(yī)學(xué)又將干眼癥稱為“神水將枯”，《審視瑤函》謂“此癥南人俗呼白眼，其病不腫不赤，只是澀痛，乃氣分隱伏之炎，脾肺絡(luò)濕熱，秋天多患此。”說明了干眼癥與五臟六腑息息相關(guān)，當(dāng)五臟六腑功能失調(diào)，其正常功能受燥邪所傷，必然會(huì)導(dǎo)致五臟津液耗傷，不能發(fā)揮其正常的生理功能，而發(fā)生本病。不同類型的干眼癥表現(xiàn)出類似眼表異常的病理改變。干眼的眼表損害主要包括角膜改變和結(jié)膜改變。角膜改變主要包括角膜上皮的形態(tài)改變、干燥失活、完整性破壞和化生，亦包括角膜敏感性降低、厚度變薄、表面規(guī)則性降低。結(jié)膜改變主要包括結(jié)膜上皮角化、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、胞核形態(tài)及致密度不同、核胞漿比下降、上皮下炎癥細(xì)胞浸潤及杯狀細(xì)胞大量丟失并接近消失[10]。

針對(duì)已知的發(fā)病機(jī)制，西醫(yī)治療干眼癥具有一定的局限性，對(duì)癥治療為主，對(duì)潛在病因未予治療。藥物多以局部用藥為主，增加角膜表面水液存留，提高角膜濕性，刺激淚液分泌等，但毒副作用較多。主要采取補(bǔ)充人工淚液、局部滴用糖皮質(zhì)激素和0.1%環(huán)孢素滴眼液等抗炎藥物治療[11]。手術(shù)治療包括淚小點(diǎn)栓塞和自體頜下腺移植[12]，但存在并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)慎重選擇。近幾年來，中西醫(yī)結(jié)合在治療干眼癥方面發(fā)展較快，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論和檢測(cè)手段，是目前干眼癥治療的一條嶄新的思路。結(jié)合古代文獻(xiàn)及現(xiàn)代臨床經(jīng)驗(yàn)，干眼癥是由淚液分泌減少或淚液的質(zhì)發(fā)生改變引起的，陰精虧虛是干眼發(fā)病的基礎(chǔ)，陰虛、內(nèi)燥、虛火浮越、津液不能上營是本病發(fā)病的主要病機(jī)，治則當(dāng)以養(yǎng)陰清熱，促進(jìn)淚液分泌為主。

近年對(duì)眼表黏蛋白層的深入研究表明，其帶有水溶性及脂溶性，能降低淚膜表面張力，同時(shí)，淚膜的光滑完整性也依賴于眼表黏蛋白的活性，淚膜中黏蛋白在角膜上皮細(xì)胞表面形成一層多糖被，使得角膜表面從疏水性轉(zhuǎn)化為可濕潤的親水性，增加水一黏蛋白在眼表的分布能力，以形成完整的淚膜濕潤眼表[13]。由結(jié)膜杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白－MUC5AC是構(gòu)成淚膜中黏蛋白層的主要成分[14]。眼表的干燥性疾病常導(dǎo)致杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)而影響?zhàn)さ鞍缀铣珊头置?。單純補(bǔ)充眼表水分很難恢復(fù)淚膜的穩(wěn)定性。因此在有效促進(jìn)淚液分泌的基礎(chǔ)上，增加眼表黏蛋白的合成和表達(dá)是恢復(fù)眼表健康的重要前提。參麥合劑是根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，篩選出鬼針草、玄參、麥冬制成的配方顆粒，《中藥大辭典》記載鬼針草具有使人流淚的作用[15]，據(jù)現(xiàn)代藥理研究報(bào)道，鬼針草具有擬膽堿能的作用，可增加淚液分泌，引起多淚。麥冬具有養(yǎng)陰清熱、潤肺的功效，適宜于陰虛肺燥導(dǎo)致的眼睛干澀，淚液分泌減少。玄參苦寒清降，咸寒而潤，主入腎經(jīng)以滋陰降火，又入血分以涼血解毒，能滋補(bǔ)肝腎，退虛熱，養(yǎng)肝明目。故三藥合用，共奏清熱養(yǎng)陰潤目之功。已有研究表明淚腺、副淚腺和結(jié)膜杯狀細(xì)胞都受副交感神經(jīng)支配，而鬼針草具有擬膽堿作用[16]能增加黏蛋白的分泌。玄參、麥冬清熱養(yǎng)陰，促進(jìn)淚液分泌。

建立一種模擬干眼病自然病因、病程的干眼模型對(duì)干眼病發(fā)病機(jī)制和治療的研究非常重要。兔干眼模型是常用的干眼動(dòng)物模型之一，本實(shí)驗(yàn)采用局部滴用0.1%苯扎氯胺構(gòu)建兔干眼模型。廣泛研究表明，滴眼液中的防腐劑與干眼癥狀有關(guān)，因此，局部使用防腐劑建立干眼模型符合干眼發(fā)病的自然原因，且局部用藥避免了機(jī)械法、免疫性、內(nèi)分泌控制等方法對(duì)全身帶來的副作用，而適當(dāng)?shù)臐舛纫脖苊饬藢?duì)眼表造成的不可逆損害，適合對(duì)干眼癥療效進(jìn)行觀察。文獻(xiàn)研究表明，局部應(yīng)用0.1%苯扎氯胺引起的兔眼表損害符合人類干眼病表現(xiàn)[6]。

Schirmer試驗(yàn)是測(cè)量淚液產(chǎn)生量的常用方法，本實(shí)驗(yàn)在表麻下進(jìn)行，藥物治療組Schirmer試紙濕長較其余兩組增加，表明參麥合劑用藥后基礎(chǔ)淚液分泌增加。熒光素鈉染色直接反映眼表損害情況。本實(shí)驗(yàn)中干眼癥組熒光素鈉染色彌漫點(diǎn)狀著色，符合干眼癥的臨床特征，藥物治療后著色面積減少，說明該藥可改善眼表健康狀況。CIC是一種簡單易行、無創(chuàng)傷、可重復(fù)性好的眼表細(xì)胞學(xué)檢查方法，被認(rèn)為是診斷干眼中最有效的病理檢查[4]，因其可以在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行，所以常使用CIC來觀察杯狀細(xì)胞密度的變化以及進(jìn)行眼表損害情況分級(jí)。CIC結(jié)果反映了干眼模型組結(jié)膜杯狀細(xì)胞減少，細(xì)胞形態(tài)改變，隨著參麥合劑灌胃治療的進(jìn)行，結(jié)膜杯狀細(xì)胞的密度增加，形態(tài)趨向正常。光學(xué)顯微鏡下觀察，在正常兔眼結(jié)膜上皮由柱狀的上皮細(xì)胞層和3－4層立方細(xì)胞構(gòu)成，PAS陽性的杯狀細(xì)胞穿插其中。干眼癥模型結(jié)膜變薄，立方細(xì)胞層消失，PAS陽性的杯狀細(xì)胞顯著減少。藥物治療后藥物治療組與正常兔眼對(duì)比結(jié)膜細(xì)胞數(shù)量未見明顯差異，結(jié)膜上皮層數(shù)較前減少。

綜上所述參麥合劑灌胃治療兔干眼模型4周后能明顯改善淚液分泌及眼表細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在干眼癥的治療方面有一定的應(yīng)用前景。為進(jìn)一步研究藥物的作用機(jī)理和臨床用藥提供了依據(jù)。

[1]葉康，王中林.中醫(yī)治療干眼癥臨床研究[J].吉林中醫(yī)藥，2010，2:114－115.

[2]Burstein NL.Preservative cytotoxic threshold for benzalkonium chloride and Chlorhexidine digluconate in cat and rabbit corneas[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1980，19:308－313.

[3]Cuiju Xiong，Dong Chen，Jingbo Liu，et al.A Rabbit Dry Eye Model Induced by Topical Medication of a Preservative Benzalkonium Chloride[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(5):1850－1856.

[4]Nelson JD.Impression cytology[J].Cornea，1988，7:71－ 81.

[5]The definition and classification of Dry Eye Disease:Report of the Definition and classification subcommittee of the international Dry Eye Work shop(2007)[J].Ocul surf，2007，5(2):75－92.

[6]Margarita Calonge，Amalia Enríquez－ de－ Salamanca，Yolanda Diebold，María J.et al.Dry Eye Disease as an Inflammatory Disorder.Ocular Immunology ＆ Inflammation，2010，18(4):244－253.

[7]Schirra F，Seitz B，Knop N，et al.Sex hormones and dry eye[J].Ophthalmologe，2009，106(11):988－94.

[8]Liu Q，McDermott AM，Miller WL.Elevated nerve growth factor in dry eye associated with established contact lens wear[J].Eye Contact Lens，2009，35(5):232－7.

[9]Zoukhri D.Effect of inflammation on lacrimal gland function[J].Exp Eye Res，2006，82(5):885－98.

[10]張梅，陳家祺，劉祖國.干眼癥的眼表改變及發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國眼耳鼻喉科雜志，2002，2(4):252－255.

[11]Murat Dogru，Kazuo Tsubota.Pharmacotherapy of dry eye[J].Expert Opin Pharmacother，2011，12(3):325－334.

[12]Fabiana de Pinho Tavares，Raphael Stehling Fernandes，Taliana Freitas Bernardes，et al.Dry Eye Disease[J].Seminars in Ophthalmology，2010，25(3):84－93.

[13]劉盛春，吳曉梅.減少瞬目頻率建立的蒸發(fā)過強(qiáng)型兔干眼模型[J].國際眼科雜志，2009，9(7):1265－1268.

[14]Jumblatt MM，McKenzie RW，Jumblatt JE.MUC5AC Mucin Is a Component of the Human Precorneal Tear Film[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1999:40(1):43－49.

[15]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典·上冊(cè)[M].上海:上海人民出版社，1997:1354.

[16]李橋，施煒，王育良，等.鬼針草治療局部滴用阿托品的兔干眼療效評(píng)價(jià)[J].江蘇中醫(yī)藥，2009，21(5):74－75.