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      7種半胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測(cè)系統(tǒng)的分析性能評(píng)價(jià)

      2013-11-20 01:03:28安崇文李海霞
      檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2013年12期
      關(guān)鍵詞:正確度半胱氨酸偏差

      安崇文, 李海霞

      (北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100034)

      近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C,Cys C)已經(jīng)成為反映腎小球?yàn)V過(guò)率功能受損的一個(gè)較理想的早期標(biāo)志物[1-2]。目前Cys C檢測(cè)系統(tǒng)較多,檢測(cè)原理不盡相同。美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果顯示Cys C檢測(cè)存在差異性較大,2011和2012年度所有參加實(shí)驗(yàn)室的變異系數(shù)(CV)為13.3%~30.7%,且采用歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ERM-DA471)進(jìn)行的正確度評(píng)價(jià)未見(jiàn)報(bào)道。因此,我們對(duì)目前國(guó)內(nèi)常用檢測(cè)系統(tǒng)[包括5個(gè)顆粒增強(qiáng)膠乳透射免疫比濁法(particle-enhanced latex turbidimetric immunoassay,PETIA)檢測(cè)系統(tǒng)、1個(gè)顆粒增強(qiáng)聚苯乙烯散射免疫比濁法(particle-enhanced polystyrene nephelometric immunoassay,PENIA)檢測(cè)系統(tǒng)、1個(gè)膠體金均相溶膠顆粒免疫(colloidal gold homogeneous sol particle immunoassay,SPIA)檢測(cè)系統(tǒng)]進(jìn)行評(píng)價(jià),分析其精密度、空白限(LoB)、抗干擾性以及正確度驗(yàn)證等性能,證實(shí)其是否能滿足預(yù)期臨床用途。

      材料和方法

      一、儀器試劑與樣本準(zhǔn)備

      1.檢測(cè)系統(tǒng) 5個(gè)PETIA檢測(cè)系統(tǒng)和1個(gè)SPIA檢測(cè)系統(tǒng)以A~F表示,PENIA檢測(cè)系統(tǒng)簡(jiǎn)稱為BNⅡ系統(tǒng)。各檢測(cè)系統(tǒng)試劑、校準(zhǔn)液批號(hào)見(jiàn)表1。

      表1 檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)源詳情

      2.儀器 5個(gè)PETIA檢測(cè)系統(tǒng)(A~E系統(tǒng))和1個(gè)SPIA檢測(cè)系統(tǒng)(F系統(tǒng))均采用HITACHI 7600-110全自動(dòng)生化分析儀,PENIA檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用SIEMENS DADE BEHRING BNⅡ特定蛋白分析儀。

      3.比對(duì)樣本 選取患者樣本46份,其Cys C濃度覆蓋整個(gè)可報(bào)告范圍,標(biāo)本無(wú)黃疸、溶血、乳糜等干擾。

      4.輔助試劑 生理鹽水來(lái)自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的0.9%氯化鈉注射液(批號(hào)1107014W),用于基礎(chǔ)空白測(cè)定和稀釋樣本;干擾物質(zhì)血紅蛋白(Hb)自配,將新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血離心,去除血漿,加生理鹽水洗滌紅細(xì)胞,重復(fù)3次,再加去離子純水使之溶血,配制成Hb干擾物;醫(yī)用脂肪乳(C14-24)由西安力邦制藥有限公司提供(批號(hào):11080S),用生理鹽水稀釋成甘油三酯(TG)濃度為4、8、15、28 mmol/L的干擾物。

      二、評(píng)價(jià)方法

      參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)評(píng)價(jià)方案對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

      1.精密度評(píng)估 參考CLSI EP5-A2文件[3]。選取患者新鮮血清,自行配制3個(gè)濃度(0.8、2.7、4.7 mg/L)的混合血清。批內(nèi)重復(fù)性:同一時(shí)間內(nèi)連續(xù)測(cè)定20次。批間重復(fù)性:連續(xù)測(cè)定10 d,每天測(cè)定2批,每批測(cè)定1次,2批間隔>2 h。計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)(CV)。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室修正法案(CLIA'88)建議:批內(nèi)CV<1/4總允許誤差(TEa)(即<3.75%),批間 CV<1/3 TEa(即<5%)[4-5];基于 CLIA'88 對(duì)生物學(xué)變異設(shè)定的分析質(zhì)量指標(biāo)中建議Cys C的精密度應(yīng)達(dá)到的理想目標(biāo)為2.3%[6-8]。

      2.正確度評(píng)估 參考 CLSI EP15-A2文件[9]。方法①:對(duì)歐洲Cys C有證參考物質(zhì)ERMDA471/IFCC[其靶值±不確定度為(5.48±0.15)mg/L]進(jìn)行檢測(cè),分析與靶值之間的偏倚;方法②:對(duì)2011年度和2012年3月CAP發(fā)放的Cys C室間質(zhì)評(píng)物進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)CLIA'88建議,TEa<±15%[4-5],基于 CLIA'88對(duì)生物學(xué)變異設(shè)定的分析質(zhì)量指標(biāo)中建議Cys C的偏倚和TEa應(yīng)達(dá)到的理想目標(biāo)分別為3.4%和7.2%[6-8]。

      3.空白限(LoB) 參考 CLSI EP17-A文件[10]。以生理鹽水作為空白樣本,每天檢測(cè)2批,每批重復(fù)2次,連續(xù)5 d,共獲得20個(gè)結(jié)果。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制成頻數(shù)分布圖,根據(jù)其分布類型再采用參數(shù)檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)方法估計(jì)LoB。

      4.抗干擾性評(píng)估 參考 CLSI EP7-A2文件[11]。收集低(0.8 mg/L)、高(7.3 mg/L)2 個(gè)濃度混合血清,在上述血清中加入Hb、TG干擾物,配制成Hb終濃度為10、13 g/L,TG終濃度為4、8、15、28 mmol/L的樣本,對(duì)照樣本加入等體積生理鹽水,每份樣本測(cè)定2次,取均值,以偏差<±10%作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

      5.相關(guān)和偏差分析 參考CLSI EP9-A2文件[12]。各系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定,每份樣本測(cè)定2次,取均值,以BNⅡ系統(tǒng)(PENIA)為參考,分析PETIA與PENIA間的相關(guān)性和偏差。相關(guān)系數(shù)(r)要求>0.975。

      三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

      統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Microsoft Excel 2003、SPSS 13.0 及 Medcalc 11.6.1 軟件。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。偏差分析應(yīng)用Bland-Altman差異分析法。

      結(jié) 果

      一、精密度評(píng)估結(jié)果

      當(dāng)Cys C 濃度為0.8~5.0 mg/L時(shí),6個(gè)系統(tǒng)(A~F)和BNⅡ系統(tǒng)總批內(nèi)CV均<3.75%,總批間CV除E系統(tǒng)外均<5%,重復(fù)性良好;其中D系統(tǒng)的精密度符合CLIA'88建議的理想目標(biāo)(CV<2.3%)。見(jiàn)表2、3。

      二、正確度評(píng)估結(jié)果

      1.A~E系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)測(cè)定ERM-DA471的絕對(duì)偏倚分別為0.00、0.00、1.01、-0.01、-0.50、-0.35 mg/L,相對(duì)偏倚分別為0%、0%、18.43%、-0.18%、-9.12%、-6.39%;F 系統(tǒng)未參與評(píng)估。其中A、B、D 3個(gè)系統(tǒng)符合CLIA'88建議達(dá)到的理想偏倚(3.4%)[6-8]。見(jiàn)表4。

      表2 6個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)(A~F)和BNⅡ系統(tǒng)的批內(nèi)精密度(%)

      表3 6個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)(A~F)和BNⅡ系統(tǒng)的批間精密度(%)

      表4 A~E系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)測(cè)定ERM-DA471的結(jié)果

      2.僅D系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)測(cè)定CAP室間質(zhì)評(píng)物的結(jié)果較為理想,滿足CLIA'88建議的理想目標(biāo)(TEa<7.2%)[6-8],其他系統(tǒng)均有 50% 的結(jié)果與CAP均值的相對(duì)偏倚超出CLIA'88建議的TEa(靶值±15%)。整體來(lái)看,PENIA測(cè)定結(jié)果低于PETIA。見(jiàn)表5。

      三、空白限(LoB)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      A~F系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)的LoB分別為0.00、0.00、0.31、0.01、0.10、0.06和<0.05 mg/L。

      四、抗干擾性驗(yàn)證結(jié)果

      當(dāng)Hb≤13 g/L、TG≤28 mmol/L時(shí)對(duì)A、B系統(tǒng)及BNⅡ系統(tǒng)無(wú)影響(干擾<±10%)。C系統(tǒng)在TG≥4 mmol/L時(shí)呈正干擾;D系統(tǒng)在TG≥28 mmol/L時(shí)對(duì)低水平Cys C呈負(fù)干擾;E系統(tǒng)在Hb≥10 g/L時(shí)對(duì)低水平Cys C呈負(fù)干擾;F系統(tǒng)在Hb≥10 g/L時(shí)對(duì)低水平Cys C呈正干擾,在TG≥15 mmol/L時(shí)對(duì)低水平Cys C呈負(fù)干擾。見(jiàn)表6。

      表5 6個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)(A~F)和BNⅡ系統(tǒng)測(cè)定CAP室間質(zhì)評(píng)物的結(jié)果 (mg/L)

      表6 6個(gè)(A~F)檢測(cè)系統(tǒng)和BNⅡ系統(tǒng)抗干擾性驗(yàn)證結(jié)果 (mg/L)

      五、相關(guān)性和偏差分析

      A~F系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的相關(guān)性較好,r分別為0.998、0.998、0.986、0.998、0.994、0.993,均>0.975(P<0.01)。Bland-Altman偏差分析顯示A~F系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的平均絕對(duì)偏差分別為-0.02、-0.10、-0.31、0.05、0.04、0.36 mg/L,平均百分偏差分別為-0.57%、2.58%、10.15%、4.92%、14.48%、8.06%。見(jiàn)圖1。

      圖1 A~F系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的偏差分析

      討 論

      目前國(guó)內(nèi)Cys C測(cè)定方法多種多樣,原理各不相同。不同體系間的偏差導(dǎo)致以Cys C作為參數(shù)估算腎小球率過(guò)濾(eGFR)的方程多樣性,這是由于測(cè)定Cys C的校準(zhǔn)品不同,方法未一致化所造成的。因此Cys C的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題受到高度重視,國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)成立了Cys C標(biāo)準(zhǔn)化工作組,工作組推薦將Cys C原級(jí)參考品添加到脫脂的人血清中,制備得到的次級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ERM-DA471/IFCC)具有良好的互通性。ERM-DA471在復(fù)溶物質(zhì)中使用顆粒增強(qiáng)膠乳散射比濁、顆粒增強(qiáng)膠乳透射比濁和酶促單向免疫擴(kuò)散3種方法來(lái)定量,有Dako、Roche Diagnostics、Siemens Healthcare Diagnostics 3 個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)參與。該定值由4個(gè)實(shí)驗(yàn)室各自檢測(cè),由7個(gè)可接受均值的未加權(quán)均值確定。目前在國(guó)內(nèi)各系統(tǒng)之間測(cè)定ERM-DA471的正確度評(píng)估未見(jiàn)報(bào)道,國(guó)產(chǎn)Cys C試劑校準(zhǔn)品溯源不統(tǒng)一,校準(zhǔn)品賦值存在差異。為此,本研究選取國(guó)內(nèi)常見(jiàn)6種檢測(cè)系統(tǒng)在HITACHI系統(tǒng)進(jìn)行分析性能驗(yàn)證,以期為臨床應(yīng)用提供信息。

      正確度驗(yàn)證顯示不同檢測(cè)系統(tǒng)之間存在著差異,測(cè)定ERM-DA471顯示PETIA法中 A、B、D 3個(gè)系統(tǒng)在可接受范圍,而C、E、BNⅡ系統(tǒng)均超出規(guī)定的不確定度,最大偏倚可達(dá)到1 mg/L,最大相對(duì)偏倚為18.43%,準(zhǔn)確性欠佳。檢測(cè)系統(tǒng)的性能需要進(jìn)一步改進(jìn)。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同儀器檢測(cè)系統(tǒng)間是否存在差異,我們對(duì)CAP室間質(zhì)控物進(jìn)行分析,其靶值統(tǒng)計(jì)是采用所有參與實(shí)驗(yàn)室按方法學(xué)或儀器分組計(jì)算中位數(shù)求得。按檢測(cè)儀器不同分為HITACHI/ROCHE全自動(dòng)生化儀系列和SIEMENS特種蛋白儀系列,結(jié)果顯示采用HITACHI系列PETIA中僅D系統(tǒng)符合CLIA'88建議的理想TEa(7.2%),SPIA也未能滿足要求;BNⅡ系統(tǒng)測(cè)定CAP質(zhì)控物偏倚雖然也在TEa(7.2%)允許范圍內(nèi),但是其不同水平的測(cè)定結(jié)果均低于HITACHI/ROCHE系列檢測(cè)系統(tǒng)。

      抗干擾性驗(yàn)證顯示C系統(tǒng)在TG≥4 mmol/L時(shí)對(duì)低水平和高水平樣本均呈正干擾(干擾>+10%),可能與C系統(tǒng)使用單波長(zhǎng)測(cè)定有關(guān),使用單波長(zhǎng)雖可提高檢測(cè)靈敏度,但不能消除脂血、乳糜帶來(lái)的濁度影響,建議C系統(tǒng)在測(cè)定脂血和乳糜血標(biāo)本時(shí)增加第2波長(zhǎng);F系統(tǒng)在Hb≥10 g/L時(shí)對(duì)低水平樣本呈正干擾(干擾>+10%),Hb≥13g/L時(shí)對(duì)高水平樣本呈正干擾(干擾>+10%),考慮F系統(tǒng)是采用SPIA,其反應(yīng)體系顏色的變化會(huì)影響Cys C的檢測(cè),因此溶血對(duì)樣本測(cè)定影響較大。

      6個(gè)系統(tǒng)(A~F)與BNⅡ系統(tǒng)相關(guān)性良好(r均>0.975,P<0.01)。Bland-Altman 差異分析顯示6個(gè)系統(tǒng)(A~F)與BNⅡ系統(tǒng)之間的平均偏差和平均百分偏差相差較大,與文獻(xiàn)[13]報(bào)道相符,其中C系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的平均偏差為-0.31 mg/L;Cys C濃度在5.0 mg/L 以上時(shí)與BNⅡ系統(tǒng)偏差較大,高濃度樣本檢測(cè)比實(shí)際濃度偏低,可能是由于鉤狀效應(yīng)的影響。當(dāng)抗原量過(guò)剩時(shí)而出現(xiàn)的后帶現(xiàn)象,導(dǎo)致免疫復(fù)合物的降低,應(yīng)當(dāng)稀釋樣本后重新進(jìn)行測(cè)定。這也說(shuō)明C系統(tǒng)的檢測(cè)線性低于BNⅡ系統(tǒng)。F系統(tǒng)與BNⅡ系統(tǒng)的平均偏差為0.36 mg/L,有研究報(bào)道顯示SPIA 與PENIA 有0.27 mg/L[14]或 32.7%[15]的正偏差,與本研究結(jié)論相似。其他4個(gè)系統(tǒng)(A、B、D、E)與BNⅡ系統(tǒng)的偏差相差不大,但E系統(tǒng)的百分偏差為14.48%,接近 CLIA'88建議的 TEa(靶值±15%)??赡苁怯捎贓系統(tǒng)的空白限偏高(為0.1 mg/L),導(dǎo)致 Cys C 在0.8 mg/L以下的低濃度時(shí)與BNⅡ系統(tǒng)比較的百分偏差較大。有報(bào)道顯示PETIA較PENIA有-0.16 mg/L的負(fù)偏差[16],還有文獻(xiàn)[17]報(bào)道稱 PETIA 較 PENIA 有-0.009 mg/L 的負(fù)偏差,另有文獻(xiàn)[15]報(bào)道顯示PETIA較 PENIA有24.5%和27.6%的正偏差。這可能是由于市場(chǎng)上銷售的Cys C試劑廠家眾多,每種試劑中Cys C抗體的效價(jià)不同,尤其是各檢測(cè)體系的校準(zhǔn)品溯源不統(tǒng)一,校準(zhǔn)品賦值存在差異,造成產(chǎn)品差異很大,嚴(yán)重影響其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果采用準(zhǔn)確賦值的校準(zhǔn)品,有可能使不用檢測(cè)體系對(duì)同一份樣品的檢測(cè)結(jié)果基本一致。本研究的不足之處是未能采用ERM-DA471驗(yàn)證各檢測(cè)體系校準(zhǔn)品賦值的準(zhǔn)確性。

      綜上所述,A、B、D 3個(gè)系統(tǒng)的各項(xiàng)性能指標(biāo)基本滿足臨床試驗(yàn)的要求;部分廠家Cys C檢測(cè)試劑的準(zhǔn)確性欠佳,且不同系統(tǒng)間結(jié)果存在一定偏差,是否可通過(guò)校正因子或統(tǒng)一校準(zhǔn)品進(jìn)行糾正,從而使檢測(cè)結(jié)果在不同系統(tǒng)間達(dá)到一致可比有待進(jìn)一步驗(yàn)證。臨床應(yīng)用中,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選用分析性能優(yōu)越的檢測(cè)系統(tǒng),通過(guò)參加室間質(zhì)評(píng)或其他渠道驗(yàn)證其正確度。

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      ARCHETECT高敏肌鈣蛋白Ⅰ試劑盒性能評(píng)價(jià)
      臨床檢驗(yàn)正確度控制品-評(píng)估偏倚
      西安地區(qū)同型半胱氨酸參考區(qū)間的初步建立
      關(guān)于均數(shù)與偏差
      對(duì)葡萄糖常規(guī)檢驗(yàn)系統(tǒng)正確度的評(píng)價(jià)
      同型半胱氨酸與慢性心力衰竭合并腎功能不全的相關(guān)性分析
      86例同型半胱氨酸與腦梗死相關(guān)性分析
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