人參二醇組皂苷對血漿血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響

韓 冬 朱 凱 劉 苗 代德強(qiáng) 張亞杰 王楚盈 劉 佳 李玉梅 李麗靜

(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117)

人參二醇組皂苷(PDS)系從五加科人參屬植物人參莖葉中提取純化所得，主要包含人參Rb1，Rb2，Rc，Rd等皂苷單體。已有研究發(fā)現(xiàn)，PDS能抗休克、抗心肌梗死、抗缺血再灌注性損傷、降低血糖及改善血脂代謝紊亂〔1～4〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PDS能改善心室重構(gòu)大鼠心臟血流動力學(xué)，減少縮血管物質(zhì)含量，提高抗氧化能力，提示其對大鼠心梗后心室重構(gòu)具有保護(hù)作用〔5，6〕。本實(shí)驗(yàn)擬探討PDS防治心室重構(gòu)的作用機(jī)制，為其開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 2日齡清潔級Wistar大鼠乳鼠〔合格證號:SCXK-(吉)2007-0003〕，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，用于體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 PDS粉末，長春中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物化學(xué)研究室提供，白色粉末狀，用氯化鈉注射液配成所需濃度，經(jīng)0.22 μm孔徑的濾膜過濾除菌后使用。卡托普利片(Captopril)購自中美上海施貴寶制藥有限公司;鏈霉素(大連美羅制藥廠)，青霉素(華北制藥廠)，胰蛋白酶(Trypsin，Invitrogen，美國)，5'-溴脫氧尿苷(5'-BrdU)(Sigma，美國)，小牛血清(Invitrogen GIBCO，美國)，高糖 DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen GIBCO，美國)，丙酮酸鈉(上海生工生物工程公司)，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3 主要儀器 熒光倒置顯微鏡(Nikon，日本)，高壓滅菌器(SANYO，日本)，超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州凈化儀器廠)，磁力攪拌器(上海普江分析儀器廠)，電子天平(ALC-10.4，上海精密科學(xué)儀器公司)，高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3K15，德國Sigma公司)，PH測試筆(PH Testr 20，EUTECH，美國)，超速低溫離心機(jī)(SORVALL，美國)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國伯樂公司)，微量振蕩器(MH-Ⅰ，海門市其林貝爾儀器公司)，紫外可見分光光度計(jì)(Helios Alpha，美國Unicam公司)，熒光分光光度計(jì)(PC150，美國瓦里安公司)，制冰機(jī)(SANYO，日本)，二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-18AIC，SANYO，日本)。

1.4 乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)、分組及處理 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng):取2日齡 Wistar大鼠乳鼠心臟，PBS清洗腔室血液，剪去心房、結(jié)締組織，將心室剪碎，1 mm3左右組織塊，0.125% 胰酶，37℃ 水浴條件下多次消化，每次約5 min。第1次消化液棄掉，多次消化，被完全消化。以10% 新生牛血清終止消化，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，細(xì)胞沉淀以 DMEM 培養(yǎng)(20% 新生牛血清液)重懸后接種于培養(yǎng)瓶，二氧化碳孵箱中(37℃、5%CO2)培養(yǎng)90 min，差速貼壁棄去成纖維細(xì)胞等其他非心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，加入5'-BrdU(0.1 mmol/L)，接種到培養(yǎng)板中，二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液。72 h后，倒置顯微鏡下見心肌細(xì)胞伸出偽足，匯聚成片，現(xiàn)同步自主搏動，隨機(jī)分為4組，每組6復(fù)孔。各組心肌細(xì)胞加入相應(yīng)濃度的PDS或等體積心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，同時加入 AngⅡ(10－7mol/L)持續(xù)作用48 h。實(shí)驗(yàn)分組及處理:正常對照組(等體積培養(yǎng)液);肥大模型組:AngⅡ(10－7mol/L);PDS低劑量組:AngⅡ(10－7mol/L)+PDS(400 μg/ml);PDS 高劑量組:AngⅡ(10－7mol/L)+PDS(800 μg/ml)。

1.5 心肌細(xì)胞表面積的測定 以每孔1 ml心肌細(xì)胞懸液(1×105個/ml)接種于24孔培養(yǎng)板中，經(jīng)上述分組處理后，用胰酶消化心肌細(xì)胞使其脫壁，反復(fù)輕柔吹散細(xì)胞，靜置后照相，利用Leica QWin病理圖像分析系統(tǒng)測定心肌細(xì)胞表面積，每組檢測5個視野，然后取平均值進(jìn)行比較。

1.6 心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的測定 以每孔2.5 ml心肌細(xì)胞懸液(3×105個/ml)接種于6孔培養(yǎng)板，經(jīng)上述分組處理后，棄除上層培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS輕柔沖洗，每孔依次加入裂解液，Western及IP細(xì)胞裂解液，用移液器吹打，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，裂解后，離心(4℃ 14 000 r/min，5 min)，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各組細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度，根據(jù)各孔細(xì)胞數(shù)計(jì)算單個細(xì)胞總蛋白含量。

1.7 心肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度［Ca2+］i的測定 以每孔2.5 ml細(xì)胞懸液(3×105個/ml)接種到6孔培養(yǎng)板中，經(jīng)上述分組處理后，用胰酶消化心肌細(xì)胞使其脫壁，要求細(xì)胞濃度達(dá)到106個/ml以上，取1 ml放入EP管中。實(shí)驗(yàn)組的每管都加入5 μl的Fura-2/AM 儲備液，使其終濃度達(dá)到5 μmol/L，搖床震動(37℃，60 min)，使Fura-2/AM與細(xì)胞充分反應(yīng)。然后離心(1 200 r/min，5 min)，以D-Hank平衡鹽溶液洗細(xì)胞2次，懸浮細(xì)胞，加到玻璃比色杯中，利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測定。先測定340 nm及380 nm激發(fā)光所產(chǎn)生熒光強(qiáng)度，然后加入Triton X-100(0.1%)，再測定340 nm和380 nm激發(fā)光所產(chǎn)生熒光強(qiáng)度，最后加入EGTA(5 mmol/L)，測定340 nm和380 nm激發(fā)光所產(chǎn)生熒光強(qiáng)度，按下列公式計(jì)算［Ca2+］i=Kd(Fd/Fs)×［(R－Rmin)/(Rmax－R)］。

1.8 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)蛋白活性測定 以2.5 ml/孔細(xì)胞懸液(1×106個/ml)接種到6孔培養(yǎng)板中，無血清培養(yǎng)液同步化經(jīng)上述分組處理后，按照CaN活性劑盒按照操作說明進(jìn)行測定。反應(yīng)終止30 min后，在660 nm測定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)磷濃度，按下列公式計(jì)算CaN活性:CaN活性［nmol/(mg·min)］=［根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)磷濃度(μmol/L)×10(體系倍數(shù))×樣品稀釋倍數(shù)］÷10(反應(yīng)時間:min)÷樣品蛋白質(zhì)量濃度(mg/ml)。

2 結(jié)果

2.1 PDS對肥大心肌細(xì)胞表面積的影響 與正常對照組〔(4.95±0.37)μm2〕相比，肥大模型組心肌細(xì)胞偽足粗大，表面積［(7.06±0.64)μm2］增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明AngⅡ引起了心肌細(xì)胞體積肥大;與肥大模型組相比，PDS低劑量組［(6.03±0.45)μm2］及高劑量組［(5.77 ±0.51)μm2］心肌細(xì)胞表面積減少(P＜0.05或P＜0.01)。

2.2 PDS對肥大心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的影響 與正常對照組相比，肥大模型組心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)濃度及單個細(xì)胞蛋白質(zhì)含量明顯增加(P＜0.01)，表明AngⅡ引起了心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增多;與肥大模型組相比，PDS低劑量組及高劑量組心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)濃度及單個細(xì)胞蛋白質(zhì)含量降低(P＜0.05)。見表1。

2.3 PDS對肥大心肌細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i的影響 與正常對照組〔(142.6±13.8)nmol/L〕相比，肥大模型組心肌細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i濃度〔(297.5±18.7)nmol/L〕明顯增加(P＜0.01);與肥大模型組相比，PDS低劑量組〔(211.4±16.9)nmol/L〕及高劑量組〔(194.6±15.3)nmol/L〕心肌細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i明顯降低(P ＜0.05)。

表1 PDS對肥大心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的影響( s，n=10)

表1 PDS對肥大心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的影響( s，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)細(xì)胞數(shù)(×105)單個細(xì)胞蛋白質(zhì)含量(pg/細(xì)胞)11.97±0.62 3.01±0.11 863.4±62.2肥大模型組 16.31±0.531) 3.06±0.14 1018.0±77.41)PDS低劑量組 14.9±0.492) 3.03±0.10 943.6±70.52)PDS高劑量組 14.2±0.452) 3.02±0.11 928.9±68.32)正常對照組

2.4 PDS對肥大心肌細(xì)胞CaN蛋白活性的影響 與正常對照組〔(11.22 ±1.36)nmol·mg－1·min－1〕相比，肥大模型組心肌細(xì)胞內(nèi) CaN 活性〔(27.58 ±2.65)nmol·mg－1·min－1〕明顯升高(P＜0.01);與肥大模型組相比，PDS低劑量組〔(18.24±2.16)nmol·mg－1·min－1〕及高劑量組〔(16.35 ±1.84)nmol·mg－1·min－1〕心肌細(xì)胞 CaN 活性明顯降低(P ＜0.05)。

3 討論

已有研究證明，神經(jīng)體液因素(AngⅡ、ET-1)、肽類生長因子(FGF、TGF-β)及機(jī)械牽張刺激等〔7〕都具有促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用。其中AngⅡ是目前被了解最多的血管收縮因子，通常被選擇作為心肌細(xì)胞肥大的誘導(dǎo)劑，本實(shí)驗(yàn)以10－7mol/L濃度誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞48 h，成功建立細(xì)胞肥大模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肥厚模型組表面積及總蛋白質(zhì)含量均明顯高于正常對照組，而PDS低劑量組及高劑量組能明顯減少肥大心肌細(xì)胞的表面積及總蛋白質(zhì)含量，表明PDS對AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大有抑制作用。

另有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+參與細(xì)胞外各種刺激及細(xì)胞內(nèi)功能紊亂所致心肌肥大〔8，9〕。當(dāng)心肌肥大發(fā)生時，心肌細(xì)胞膜上鈣離子受體密度增大，增加幅度與細(xì)胞肥大程度相關(guān)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯升高，而PDS低劑量組及高劑量組可降低肥大心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，說明PDS能調(diào)整肥大心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，從而發(fā)揮其抑制心肌細(xì)胞肥大的藥理作用。

CaN是一類絲/蘇氨酸蛋白酶，依賴于鈣及鈣調(diào)素，主要表達(dá)于胞質(zhì)。當(dāng)鈣和鈣調(diào)素與CaN的調(diào)節(jié)亞單位和催化亞單位結(jié)合時，使CaN活化。CaN活化后與胞質(zhì)活化T細(xì)胞因子3(NFAT3)結(jié)合，使其去磷酸化轉(zhuǎn)位入核，與富含GGAAAAT的DNA結(jié)合區(qū)和鋅指轉(zhuǎn)錄因子(GATA4)結(jié)合，誘導(dǎo)心臟胚胎期基因ANP、β-MHC等的表達(dá)，促進(jìn)心肌肥大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PDS對AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用與阻斷鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。

1 劉 潔，夏映紅，李天舒，等.人參二醇皂苷對失血性休克犬過氧化脂質(zhì)和超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007;13(7):41-3.

2 劉 潔，劉 芬，王秋靜，等.人參二醇組皂苷對心肌梗死犬血清一氧化氮、一氧化氮合酶水平的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008;14(4):64-7.

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5 韓 冬，曲紹春，于曉風(fēng)，等.人參二醇組皂苷對心室重構(gòu)大鼠的抗氧化作用及神經(jīng)內(nèi)分泌因子的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010;14(11):1701-3.

6 韓 冬，于曉風(fēng)，曲紹春，等.人參二醇組皂苷對心肌梗死后心室重構(gòu)大鼠心臟形態(tài)學(xué)及血流動力學(xué)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(1):57-9.

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9 Molkentin JD.Calcineurin and beyond:cardiac hypertrophic signaling〔J〕.Circ Res，2000;87(9):731-8.

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