五指山小型豬急性心肌梗死合并急性心力衰竭模型的建立及評價

顧曉龍 黃 軍 董正華 雷輝燕 龔志華 文艷飛 向定成

(南方醫(yī)科大學研究生學院，廣東 廣州 510515)

急性心肌梗死已成為充血性心力衰竭的主要原因〔1〕，而一旦出現(xiàn)心力衰竭會使患者短期和長期死亡率均明顯增加，因心衰再次住院次數(shù)也明顯增多〔2〕。動物實驗研究急性心肌梗死合并急性心力衰竭的病理生理過程，對于指導臨床診斷及治療具有重要的意義。成功復制相似的動物模型是進行相關實驗的基礎。小型豬因其在冠脈方面與人類存在高度相似性，一直是人類心血管疾病模型制備研究的優(yōu)選動物。本研究使用介入封堵法建立五指山小型豬急性心肌梗死合并急性心力衰竭模型，并通過超聲心動圖及血流動力學進行心功能評估。

1 材料與方法

1.1 動物 健康五指山小型豬16頭(質量合格證號:0087537，批號:4407700010)，(9±2.3)月齡，雌雄不限，體重(24±5.6)kg，由廣州軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供。實驗前小型豬均在動物實驗中心隔離檢1 w。所有動物飼養(yǎng)及實驗過程均按照動物實驗的3R原則進行。

1.2 方法

1.2.1 術前準備與麻醉 所有小型豬均禁食8 h以上，肌肉注射氯胺酮200 mg，速眠新0.5 ml，咪達唑侖5 mg誘導麻醉后，清洗皮膚并行胸部及雙腹股溝備皮，稱重后運至心內科導管室，將豬仰臥固定于手術臺，頭偏向一側，牙墊固定，持續(xù)低流量吸氧。經(jīng)耳后靜脈建立靜脈通路給以5%葡萄糖+10%氯化鉀維持靜滴，胸部及四肢接電極，分別記錄術前及術中心電圖，同時連接心電監(jiān)護監(jiān)測心率及心律，除顫儀接電極同步復律備用。維持麻醉給以氯胺酮50 mg+咪達唑侖5 mg，5 ml/h持續(xù)泵入，根據(jù)肢體活動及眼球轉動情況對麻醉藥物劑量進行調整，術前0.5 h開始靜脈滴注青霉素480萬單位+0.9%氯化鈉100 ml。

1.2.2 股動靜脈切開穿刺 10%利多卡因于腹股溝處作局部麻醉，然后沿血管走行方向切開皮膚4～5 cm，用蚊式止血鉗分離組織，順血管走行方向鈍性分離筋膜和肌肉，顯露股動靜脈和股神經(jīng)，然后分離股動、靜脈間的結締組織，清楚地暴露股動脈及股靜脈。在其下方各穿2根1號線備用。提拉近心段結扎線，將穿刺針斜面向下，與水平面呈60°角刺向血管壁，可回抽出血液后，立即將注射器角度放平，并保持原位不動，送入導絲，固定導絲后退出穿刺針，沿著導絲送入6 F帶擴張器的鞘管(股靜脈送入7 F鞘管)，固定鞘管拔出擴張器及導絲，以肝素鹽水沖管，靜注肝素5 000 U，后每隔1 h追加1 000 U。

1.2.3 模型制備 在大型DSA(SIEMENS Artis)機下，通過導絲的引導送入6FJR3.5指引導管到左冠開口，行左冠狀動脈造影，送入0.014×185 cm Runthrough指引導絲到左前降支(LAD)遠端，根據(jù)LAD近中段內徑選擇相應球囊，均選擇2.5×20 mm Sprinter球囊定位于前降支近段(第一對角支開口處)，3～4 atm擴張球囊，重復造影確認冠脈血流完全中斷，開始行缺血預適應，先后阻斷前向血流1、2、5 min，間隔1 min/次，根據(jù)該時間段是否引起頻發(fā)室早、室速或室顫，決定每個阻斷時間重復次數(shù)，心律穩(wěn)定后持續(xù)阻斷前向血流180 min。180 min后撤出球囊、導絲。

1.2.4 術后處理 手術結束后結扎血管逐層縫合，縫合前生理鹽水沖洗傷口，擠出傷口內的液體及積血，縫合皮膚后對皮，酒精消毒，慶大霉素4萬單位傷口外用，兩組均送回動物實驗室，給予青霉素480萬單位2次/d肌肉注射，共3 d。

1.2.5 有創(chuàng)血流動力學參數(shù)測定 在進入指引導管即刻至手術結束，連續(xù)監(jiān)測動脈壓力變化。α漂浮導管血流動力學監(jiān)測:經(jīng)股靜脈插入7 F五腔溫敏球囊漂浮導管至肺動脈分支。在球囊封堵前，封堵后10、20、30、60 min，分別以漂浮導管測量中心靜脈壓(CVP)、肺動脈收縮壓(PASP)及肺毛細血管楔嵌壓(PCWP)，應用熱稀釋法測量心輸出量(CO)。以制模后PASP≥18 mmHg和心輸出量較制模前下降30%以上為達到動物模型標準。

1.2.6 超聲心動圖監(jiān)測 分別于制模前、后0.5、1、2、3 h行心臟超聲檢查，測定左室射血分數(shù)(LVEF)及左室舒張末徑(LVSDd)，同時觀察室壁運動情況。

1.2.7 病理檢查 術后24 h靜脈注射10%氯化鉀20 ml將豬處死，取出心臟，于左室前壁梗死區(qū)中心分別切取5 mm×3 mm的組織4塊，置入4%的甲醛固定液中固定24 h后，制備4 μm厚度石蠟切片，并行伊紅(HE)染色。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以s表示，自身前后比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 一般情況 所有小型豬共有13頭存活，存活率81.25%，其中12頭達到預期的心衰模型，模型成功率75.00%。1頭因股動脈出血致出血性休克死亡，1頭因球囊封堵后出現(xiàn)頑固性室顫而死亡，1頭術后24 h猝死，1頭雖心梗模型制作成功但一直達到心衰標準。所有小型豬手術過程中均出現(xiàn)不同程度的室性心律失常，均無感染發(fā)生。

2.2 心電圖改變 當球囊將LAD封堵至血流TIMI 0級，即刻可見胸前導聯(lián)及T波高聳，1 min后出現(xiàn)ST段弓背或水平狀抬高，部分小型豬可累及下壁及側壁導聯(lián)。

2.3 血流動力學變化 球囊封堵后10、20、30、60 min與球囊封堵前相比，HR、PAP、PCWP均顯著上升(P ＜0.05)，30 min與60 min相比無統(tǒng)計學差異，30 min比20 min及10 min均顯著上升，而BP、CO顯著降低(P＜0.05)，30 min與60 min相比無統(tǒng)計學差異，30 min比20 min及10 min均顯著上升，CVP僅在30 min及60 min時與封堵前相比顯著上升(P＜0.05)。見表1。

表1 封堵前后血流動力學指標變化( s，n=12)

表1 封堵前后血流動力學指標變化( s，n=12)

與術前比較:1)P＜0.05，下表同

時間 HR(次/min)BP(mmHg)CVP(mmHg)PAP(mmHg)PCWP(mmHg)CO(L/min)5.80 11.00±1.41 3.56±1.33術后10 min 91.50±9.851) 98.25±14.321) 14.25±2.06 30.75±4.431) 16.75±3.181) 2.71±0.941)術后20 min 101.50±11.971) 95.75±13.801) 16.00±2.94 31.75±5.911) 22.00±4.361) 2.39±0.991)術后30 min 106.75±11.031) 93.5±9.041) 17.00±0.821) 34.25±6.931) 24.50±5.741) 2.17±0.861)術后60 min 105.50±18.481) 97.75±10.921) 16.25±2.501) 33.00±5.891) 23.75±5.121) 2.19±0.501)術前 84.00±16.69 119.00±10.89 15.00±1.41 25.75±

2.4 超聲心動圖檢查 球囊封堵前及封堵后10、20、30、60 min行心臟彩超檢查，LVEF值10 min與封堵前相比無統(tǒng)計學差異，20、30及60 min與封堵前相比顯著下降(P＜0.05)，觀察時間內均可見前壁、室間隔(或)合并下壁活動異常，60 min內LVSDd與封堵前比未見擴大，所有小型豬均未出現(xiàn)室壁瘤。見表2。

表2 封堵前后心臟彩超指標變化( s，n=12)

表2 封堵前后心臟彩超指標變化( s，n=12)

時間 LVEF(%)LVEDd(mm)66.25±6.24 32.08±1.64術后10 min 65.54±7.59 32.65±2.83術后20 min 58.00±4.421) 32.96±2.54術后30 min 55.50±2.651) 33.33±2.50術后60 min 52.00±5.831)術前32.15±2.18

2.5 病理檢查 24 h病理大體標本顯示左室下壁前部、心尖部、左室前壁和前間隔部顏色變白，未見變薄。HE染色顯示梗死區(qū)域心肌出現(xiàn)灶性凝固性壞死，間質水腫，炎癥細胞浸潤。

3 討論

急性心肌梗死是由于冠狀動脈急性閉塞，導致血流中斷，心肌細胞發(fā)生損傷或壞死，心肌梗死面積較大時可導致大量心肌細胞喪失收縮功能，從而使左室收縮功能下降導致急性心功能不全的發(fā)生。急性心肌梗死伴急性心力衰竭短期以及長期死亡率均較高〔3～5〕。建立良好的動物模型是進行實驗研究的重要步驟。

建立模型的方法分為兩類，一類是外科手術法，即開胸結扎冠狀動脈〔6，7〕，但該方法創(chuàng)傷大，且可導致動物出入量失衡影響心力衰竭的研究，因創(chuàng)傷大，死亡率較高。另一類是介入法。近年來隨著冠脈介入治療的普及，廢棄導管、導絲和球囊等使介入法制作心血管模型成為可能〔8，9〕。小型豬與小鼠、兔等相比體型較大，操作方便，抵抗力及耐受性好，且其冠脈分支及走行等方面與人很相似，尤其是冠狀動脈的側支循環(huán)分布都較少，不易建立側支循環(huán)〔10〕。因此，小型豬常被用做急性心肌梗死的實驗研究。

國內有學者在小型豬用球囊封堵120 min結合微血栓微球混懸液灌注方法建立急性心肌梗死伴心力衰竭模型〔11〕，該方法急性心肌梗死范圍小且主要目的為建立慢性心衰模型，而非急性心力衰竭模型。本研究旨在建立急性心肌梗死伴急性心力衰竭模型，從而為研究其機制及用藥提供幫助。本研究中超聲心動圖所觀察到的射血分數(shù)下降程度不及CO下降程度，考慮可能原因為心功能下降在超聲表現(xiàn)會適當滯后。

本研究制摸過程中有三大難點:(1)股動脈穿刺困難，因豬股動脈相對細小，皮膚組織較厚，所以盲穿成功率低，故選擇切開暴露后穿刺，但切開暴露后因血管失去組織牽拉，穿刺針容易進入夾層或穿破血管，解決方法選擇盡量鋒利穿刺針，開始穿刺時進針角度盡量大。(2)在封堵冠狀動脈后除1頭外所有的小型豬均出現(xiàn)室速或室顫，考慮原因:與小型豬側支循環(huán)少對缺血敏感有關;與冠狀動脈封堵位置較高導致心肌缺血面積較大有關，這無疑大大增加死亡率的發(fā)生，解決方法首要的是做好缺血預適應，可適當延長缺血預適應時間，其次是搶救措施需得力，本研究團隊均為有臨床經(jīng)驗的醫(yī)師參與進行，對于病情的預測判斷及采取措施、使用藥物均按臨床規(guī)范使用，所以搶救成功率較高，圍術期并發(fā)癥相對低，死亡的發(fā)生主要出現(xiàn)在實驗初期摸索階段。(3)本研究封堵前降支位置為第一對角支處，該位置高于以往大部分心梗模型，既往的封堵位置多數(shù)在第二對角支甚至更遠，這導致實驗動物的風險大大增加，心律失常、心源性休克的發(fā)生增多，經(jīng)過積極的搶救，并未造成過多的動物死亡，這也正是本研究的特色，只有缺血范圍廣泛才可能造成急性心肌梗死模型。

1 Gheorghiade M，Bonow RO.Chronic heart failure in the United States:a manifestation of coronary artery disease〔J〕.Circulation，1998;97:282-9.

2 Velazquez EJ，F(xiàn)rancis CG，Armstrong PW，et al.for the VALIANT registry.An international prospective on heart failure and left ventricular dysfunction complicating myocardial infarction:the VALIANT registry〔J〕.Eur Heart J，2004;25:1911-9.

3 Peel AAF，Semple T，Wang I，et al.A coronary prognostic index for grading the severity of infarction〔J〕.Br Heart J，1962;24:745-60.

4 Killip T，Kimball J.Treatment of myocardial infarction in a coronary care unit:a two-year experience with 250 patients〔J〕.Am J Cardiol，1967;20:457-64.

5 Norris RM，Brandt PW，Caughey DE，et al.A new coronary prognostic index〔J〕.Lancet，1969;1:274-78.

6 Hasenfuss G.Animal model of human cardiovascular disease，heart failure and hypertrophy〔J〕.Cardiovasc Res，1998;39:60-76.

7 黃浙勇，葛均波，張少衡，等.豬急性心肌梗死模型發(fā)生心室顫動的相關因素分析〔J〕.中國實驗動物學報，2007;15(2):351-4.

8 李永秋，徐 明，姚紹鑫，等.實驗性家兔頸動脈球囊擴張動脈狹窄動物模型的建立〔J〕.中國動脈硬化雜志，2003;11:263-6.

9 吳建秋.腹主動脈瘤動物模型研究進展〔J〕.中國動脈硬化雜志，2001;9:264-7.

10 周吉林，鐘炳棠，黃 悅，等.豬心的應用解剖〔J〕.浙江醫(yī)科大學學報，1998;27:254-6.

11 張 晶，傅向華.小型豬急性心肌梗死后心力衰竭模型的構建〔J〕.中國實驗動物學報，2010;18(1):33-36.