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    肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在TRAIL促進(jìn)原代肝星狀細(xì)胞凋亡中的作用

    2013-11-20 08:38:44張君紅姜海行覃山羽孟云超沈妍華
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2013年23期
    關(guān)鍵詞:傳代原代抑制率

    張君紅 姜海行 覃山羽 孟云超 寧 琳 楊 文 沈妍華

    (廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科,廣西 南寧 530021)

    研究表明肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是活化的肝星狀細(xì)胞(HSCs)合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)〔1〕。前期研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF),能促進(jìn)HSCs-T6的凋亡,可能與下調(diào)RhoA的表達(dá)有關(guān)〔2〕;而活化的HSCs系LX-2可以通過(guò)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)TRAIL-R2途徑凋亡〔3〕。本研究發(fā)現(xiàn)HSC-T6與原代HSCs的生物學(xué)特性有明顯區(qū)別,因原代HSCs更接近人體的生理狀態(tài),選擇原代HSCs作為研究對(duì)象對(duì)臨床的應(yīng)用更具有指導(dǎo)意義,而HGF及TRAIL在原代HSCs中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討HGF在TRAIL促進(jìn)原代HSCs凋亡中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料 原代HSCs由廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院張國(guó)博士惠贈(zèng)。主要試劑及儀器:HGF、TRAIL蛋白(Peprotech公司);低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);兔抗鼠DR5多克隆抗體(Abcam公司);優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone公司);Annexin-V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒(Biovision公司);熒光倒置相差顯微鏡(Zeiss公司)。

    1.2 方法 原代HSCs復(fù)蘇、傳代與活化鑒定:從液氮灌中取出大鼠原代HSCs,37℃凍融后傳代使用,于L-DMEM培養(yǎng)液(15%胎牛血清)、37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d后80%~90%的細(xì)胞鋪滿瓶底即可再次傳代,倒置相差顯微鏡下觀察活體細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞增殖明顯可用于實(shí)驗(yàn)。

    1.3 分組 ①空白對(duì)照組:單純HSCs培養(yǎng);② HGF組:單純培養(yǎng)HSCs,將100 ng/ml HGF作用于 HSCs;③ TRAIL組:將2 μg/ml TRAIL作用于HSCs;④ HGF+TRAIL組:將100 ng/ml HGF預(yù)先刺激HSCs 24 h,再加入2 μg/ml的 TRAIL。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后采用倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察活體細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞儀Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測(cè)HSCs凋亡以及Western印跡法檢測(cè)HSCs表面DR5蛋白的表達(dá)。

    1.4 MTT法檢測(cè)各濃度HGF及TRAIL對(duì)HSCs增殖抑制率①將HSCs用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105/ml,吹打,混勻;② 取96孔板,每孔加入100 μl(3 000個(gè)細(xì)胞),每時(shí)段設(shè)3個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁后分別加入50、100、150、200 ng/ml HGF 以及0.5、1、1.5、2 μg/ml的TRAIL蛋白,每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別作用24 h及48 h,每孔加入10 μl MTT溶液,繼續(xù)在37℃,5%CO2培箱中培養(yǎng)4 h;③置96孔板于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后,去除培養(yǎng)基,加150 μl DMSO充分溶解,在Biomark酶標(biāo)儀,490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔OD值,并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

    1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HSCs的凋亡及Western印跡法檢測(cè)HSCs DR5蛋白的表達(dá) HGF組及TRAIL組分別加入100 ng/ml HGF及2 μg/ml TRAIL 作用于 HSCs;HGF+TRAIL組中加入100 ng/ml HGF預(yù)處理24 h后再加入2 μg/ml的TRAIL,作用24、48 h后收集HSCs,使用PBS液懸混,采用 Annexin-V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)凋亡及Western印跡法檢測(cè)HSCs的DR5蛋白表達(dá),DR5濃度1∶200,其余嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書操作。

    2 結(jié)果

    2.1 HSCs的復(fù)蘇、傳代、形態(tài)學(xué)觀察 復(fù)蘇的HSCs第3天即可傳代,傳代的HSCs貼壁6 h后,開(kāi)始伸展,胞體增大呈多邊形,表現(xiàn)為肌成纖維母細(xì)胞的特點(diǎn),伸出許多細(xì)長(zhǎng)偽足,呈星形外觀。見(jiàn)圖1。

    圖1 倒置相差熒光顯微鏡下復(fù)蘇的第四代HSCs形態(tài)

    2.2 HGF及TRAIL對(duì)HSCs的增殖抑制率 HGF在50、100、150、200 ng/ml各濃度下增殖抑制率〔分別為(17.6±1.7)%、(19.1±2.5)%、(20.9±2.8)%、(18.7±2.1)%〕無(wú)明顯差異(P >0.05);TRAIL 在0.5、1、1.5 μg/ml各濃度下對(duì) HSCs的增殖抑制率〔分別為(4.7±0.75)%、(4.4±1.3)%、(6.2±0.78)%〕無(wú)明顯差異(P>0.05);TRAIL在2 μg/ml作用下對(duì)HSCs有抑制作用,24 h及48 h增殖抑制率〔分別為(8.03±1.2)%、(24.6±0.8)%〕有顯著差異(P<0.01)。

    2.3 各組中HSCs的凋亡情況及DR5蛋白的表達(dá) HGF+TRAIL組凋亡率明顯高于空白對(duì)照組、HGF組(P<0.05)。TRAIL組DR5蛋白明顯高于空白對(duì)照組、HGF組及TRAIL組(P <0.01)。見(jiàn)表1,表2。

    表1 各組各時(shí)間段凋亡率(s,%,n=3)

    表1 各組各時(shí)間段凋亡率(s,%,n=3)

    與空白對(duì)照組比較:1)P<0.01,2)P<0.05,下表同

    時(shí)間 空白對(duì)照組 HGF組 TRAIL組 HGF+TRAIL組24 h 41.8±2.2 34.5±2.7 50.2±1.31) 58.2±2.21)48 h 44.0±1.7 49.5±1.12) 54.2±1.91) 67.0±1.41)

    表2 各組各時(shí)間段DR5蛋白相對(duì)表達(dá)量(s,%,n=3)

    表2 各組各時(shí)間段DR5蛋白相對(duì)表達(dá)量(s,%,n=3)

    時(shí)間 空白對(duì)照組 HGF組 TRAIL組 HGF+TRAIL組24 h 0.25±0.1 0.26±0.13 0.39±0.121)0.48±0.111)48 h 0.25±0.2 0.28±0.11 0.65±0.171)0.97±0.121)

    3 討論

    HSCs是位于肝竇間隙的一種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,正常情況下HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)其被激活,合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),膠原合成明顯增多,HSCs的激活與增殖在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵的作用〔1〕,因此促進(jìn)HSCs凋亡,減少ECM分泌及膠原的合成,是緩解肝纖維化的關(guān)鍵〔4,5〕。

    研究表明,參與HSCs凋亡的途徑主要有4條〔6〕,包括Fas-Fasl途徑、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(NGF)及NGFR途徑、外源性損傷途徑及TRAIL-TRAILR途徑。其中TRAIL-TRAILR途徑占重要地位。TRAIL是TNF家族成員之一,其中包括含有死亡結(jié)構(gòu)域TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5),與TRAIL結(jié)合時(shí)通過(guò)死亡結(jié)構(gòu)域之間的相互識(shí)別作用與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡區(qū)域(FADD)結(jié)合與pro-caspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物,活化的caspase-8釋放到胞質(zhì)中啟動(dòng)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。HSC-T6是一種永生細(xì)胞系,與原代HSCs在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特征均有不同之處。本研究表明外源性HGF在50~200 ng/ml濃度范圍對(duì)HSCs的凋亡不起作用,與國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果一致〔7〕。隨著TRAIL濃度的不斷增高,表現(xiàn)為細(xì)胞壞死。本結(jié)果說(shuō)明HGF能增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的中晚期細(xì)胞凋亡,可能與主要調(diào)控中晚期凋亡的蛋白有關(guān),HGF在對(duì)HSCs的抑制作用中不是直接的啟動(dòng)因素,而需介導(dǎo)某些中介因素發(fā)揮其作用,TRAIL可能是其中因素之一。

    HGF是一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子,其通常以單鏈無(wú)活性前體合成及分泌〔8〕,在HGF前體激動(dòng)劑HGFA的作用下被水解成有活性的HGF雙鏈,包括重鏈(α鏈)及無(wú)活性的輕鏈(β鏈),活化后的HGF與受體結(jié)合引起酪氨酸激酶活化,通過(guò)激活不同信號(hào)通路產(chǎn)生多種生物學(xué)功能如促細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及血管形成等。研究發(fā)現(xiàn),HGF對(duì)于不同的細(xì)胞類型發(fā)揮著細(xì)胞保護(hù)和促進(jìn)細(xì)胞死亡的雙重作用〔9,10〕。HGF的表達(dá)可以活化Akt、上調(diào)Bcl-xl對(duì)Fas介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用〔11〕。Tulasne等〔12〕研究表明激活 HGF/c-met信號(hào)不同的下游信號(hào)分子可以抑制肝細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)HSCs凋亡的雙重作用。本研究中在使用Western印跡法檢測(cè)DR5蛋白的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)HGF預(yù)先作用HSCs 24 h后可以上調(diào)HSCs表面DR5蛋白的表達(dá),而DR5為TRAIL的特異性受體,其活性較DR4高103倍,在誘導(dǎo)HSCs凋亡的作用中占主要地位,即HGF上調(diào)DR5表達(dá)后增強(qiáng)了TRAIL誘導(dǎo)凋亡的作用,HGF可能是TRAIL及DR5的激動(dòng)劑,可為TRAIL及激動(dòng)劑治療肝纖維化提供新的思路,然而體內(nèi)外的環(huán)境大相徑庭,加之動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床實(shí)驗(yàn)之間的結(jié)果相差甚遠(yuǎn),本研究?jī)H為臨床治療提供初步的思路。

    1 Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis〔J〕.Gastroenterology,2008;134(6):1655-69.

    2 陳國(guó)忠,姜海行,陸正峰,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡和RohA表達(dá)的調(diào)控〔J〕.世界華人消化雜志,2010;18(16):1643-9.

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