蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub對2型糖尿病大鼠體重、血糖和胰島素水平的影響

周慶峰 趙文峰 馬 亢 滑 冰 (商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000)

磺酰脲類藥物是目前應(yīng)用最早、品種最多、臨床應(yīng)用也最為廣泛的2型糖尿病口服治療藥物，其主要通過促進內(nèi)源性胰島素的分泌來降低血糖〔1〕。然而，磺酰脲類藥物在應(yīng)用過程中還是暴露出一些缺點。如藥效持續(xù)性差、易導(dǎo)致患者出現(xiàn)低血糖癥狀、易產(chǎn)生耐藥性等問題〔2〕。蛙皮抗菌肽(Brevinin-2Gub)是于2008年提取自亞洲青蛙皮膚的抗菌肽，由30個氨基酸所構(gòu)成，除具有廣譜的抗菌作用外，Brevinin-2GUb還具有顯著的促胰島素分泌作用，這種促分泌作用與國內(nèi)外備受關(guān)注的胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1)、腸促胰島素的促分泌效果相近，因此有望成為一種新型的糖尿病治療藥物〔3，4〕。目前Brevinin-2Gub促胰島素分泌的相關(guān)研究大都停留在體外細胞水平上，而對糖尿病大鼠動物模型的藥效研究還很少〔5〕，因此，本研究選擇實驗性糖尿病大鼠動物模型，通過皮下注射方式，觀察Brevinin-2Gub給藥后對正常大鼠和糖尿病大鼠體重、血糖和胰島素分泌情況的影響，同時選擇臨床常用促胰島素分泌藥物格列吡脲作為實驗對照，旨在更全面了解該藥物的生物藥效特性。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡雄性SPF級Wistar大鼠56只，體重(200±20)g，由商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑 Brevinin-2Gub購自上海吉爾多肽有限公司;胰島素放射免疫試劑盒購自上?？翟瓷锟萍加邢薰?快速血糖儀及血糖試紙購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司;格列苯脲片購自上海雷允上藥業(yè)有限公司。

1.3 模型制備與分組 首先隨機將大鼠分為2個大組，對照組(n=16)和模型組(n=48)。對照組采用常規(guī)飼料 (12%蛋白質(zhì)、5%脂肪、67%碳水化合物、16%其他)喂養(yǎng);同時又分為正常對照組(n=8)和正常給藥組(n=8)，正常對照組僅注射等體積的生理鹽水，正常給藥組注射劑量為10 μg·kg－1·d－1的Brevinin-2Gub溶液。模型組采用高糖高脂飼料 (10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)。采用高脂飼料8 w(成肥胖鼠)后，采用40 mg/kg STZ進行腹腔注射，注射STZ 72 h后禁食10 h測定空腹血糖，不同時間內(nèi)兩次空腹血糖≥7.8 mmol/L，并穩(wěn)定10 d以上，且造模前后大鼠體重?zé)o明顯改變，即成2型糖尿病大鼠模型〔6〕。建模成功后，將模型組大鼠隨機分為糖尿病組(n=8)，Brevinin-2Gub給藥組(n=24)和格列苯脲組(n=8，每日給予灌胃50 mg·kg－1·d－1格列苯脲，連續(xù) 2 w)。Brevinin-2Gub 給藥組再隨機分為 Brevinin-2Gub 高劑量 (20 μg·kg－1·d－1)、中劑量(10 μg·kg－1·d－1)和低劑量 (5 μg·kg－1·d－1)組，每組 8只，每日皮下注射1次，連續(xù)2 w。正常對照組和糖尿病組給予等體積的生理鹽水作為對照〔7〕。實驗動物均采取單籠喂養(yǎng)。Brevinin-2Gub藥物凍干粉按每天給藥量分裝于無菌離心管中，4℃保存，每次給藥時用無菌 PBS溶解。

1.4 檢測指標(biāo) 體重檢測:分別于治療第3天、第7天和第14天，采用電子天平測量大鼠體重?？崭寡菣z測:大鼠禁食10 h后，于其尾靜脈采血，按照血糖儀的說明，采取大鼠尾靜脈檢測各組動物的空腹血糖。胰島素檢測:采用放射免疫試劑盒檢測各組試驗大鼠血清胰島素水平變化。

2 結(jié)果

2.1 Brevinin-2Gub對實驗大鼠體重的影響 正常對照組比較，糖尿病組體重明顯降低(P＜0.01)，表明實驗大鼠出現(xiàn)糖尿病高消耗癥狀。與糖尿病組比較，格列苯脲組和各劑量Brevinin-2Gub給藥組在給藥期間體重緩慢升高，說明Brevinin-2Gub能夠在一定程度上緩解大鼠糖尿病高消耗癥狀，其中格列苯脲給藥組大鼠體重水平增加最高，高劑量Brevinin-2Gub給藥組次之，之后依次是Brevinin-2Gub中劑量組和低劑量組。見表1。

2.2 Brevinin-2Gub對實驗大鼠血糖的影響 與正常對照組相比，正常給藥組大鼠血糖水平變化無顯著性差異，糖尿病組血糖顯著升高(P＜0.01)，表明糖尿病大鼠模型造模成功。與糖尿病組比較，Brevinin-2Gub給藥后，各劑量組糖尿病大鼠血糖在第3天、第7天和第14天均有明顯下降，其中Brevinin-2Gub高劑量給藥組第7天血糖降低較為顯著(P＜0.01)。而與格列苯脲組相比，各劑量Brevinin-2Gub給藥組處理后血糖降低水平均低于格列苯脲(P＜0.01)。見表1。

2.3 Brevinin-2Gub對實驗大鼠胰島素釋放的影響 與正常對照組相比，正常給藥組在第3天、第7天和第14天胰島素水平均有上升(P＜0.01)。與糖尿病組比較，Brevinin-2Gub給藥后，糖尿病大鼠胰島素水平在第3天、第7天和第14天也均有明顯上升(P＜0.01)，其中高劑量Brevinin-2Gub給藥組胰島素水平升高最為顯著(P＜0.01)。而與格列苯脲組相比，各劑量Brevinin-2Gub給藥組處理后胰島素水平升高幅度均低于格列苯脲(P＜0.01)。見表1。

表1 蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub對實驗大鼠體重、血糖、胰島素釋放的影響( s，n=8)

表1 蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub對實驗大鼠體重、血糖、胰島素釋放的影響( s，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.01;與糖尿病模型組比較:2)P＜0.01;與陽性藥物對照組比較:3)P＜0.01

5 49.42±9.83正常給藥組 209.5±27.5 246.8±21.7 266.2±24.8 6.63±0.42 6.06±0.28 6.39±0.46 58.52±10.741)59.92±9.751)61.25±9.381)糖尿病模型組 182.2±32.61) 214.9±31.61) 218.9±21.81) 23.21±1.621) 24.9±1.391) 21.42±1.851) 25.63±7.67 23.73±11.24 25.44±10.29低劑量組 186.6±22.13)4)219.1±21.33)4)219.2±28.33)4)22.33±2.012)4)21.10±1.763)4)19.62±1.353)4)26.34±9.192)3)25.56±7.713)4)25.62±9.313)4)中劑量組 196.8±31.92)3)212.3±26.72)3)211.1±34.72)3)20.85±1.523)4)19.36±0.773)4)19.12±1.733)4)29.83±8.463)4)29.34±7.873)4)29.14±7.663)4)高劑量組 198.4±23.22)3)225.6±21.42)3)227.9±26.82)3)19.46±1.283)4)18.2±1.443)4)18.9±1.273)4)30.63±7.373)4)30.91±8.433)4)31.95±8.273)4)格列苯脲組 197.9±30.6 225.3±32.1 236.7±21.1 17.91±0.86 15.34±1.17 14.72±1.21 35.92±0.86 36.63±1.正常對照組 212.7±29.2 248.1±26.8 267.4±31.3 6.62±0.31 6.17±0.43 6.43±0.37 49.23±12.31 49.56±11.8 15 39.77±1.46

3 討論

蛙科是全球分布最廣泛的兩棲動物，種類超過650種，其皮膚分泌物是重要的藥用資源之一，蛙皮抗菌肽就是這些活性化合物中最重要的一種〔8〕。近幾年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列具有促胰島素釋放作用的蛙皮抗菌肽，如 Brevinin-1、Brevinin-2、Pseudin-2和Esculentins-1等家族抗菌肽，這些抗菌肽可顯著促進體外培養(yǎng)的胰島細胞株的胰島素分泌，有望替代磺酰脲類藥物成為新型糖尿病治療藥物〔9，10〕，Brevinin-2Gub就是其中最有潛力的一種。因此在本研究中，我們選擇了蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub作為研究對象，進一步明確蛙皮抗菌肽在糖尿病動物模型中的藥理效應(yīng)。

本文結(jié)果表明單獨應(yīng)用Brevinin-2Gub對正常大鼠體重?zé)o明顯影響，而糖尿病組大鼠體重下降較為明顯，一方面可能是由于造模過程中對大鼠身體產(chǎn)生的傷害，導(dǎo)致大鼠食欲下降，另一方面與糖尿病導(dǎo)致的高消耗也有密切關(guān)系。Brevinin-2Gub各劑量組均能顯著減輕糖尿病大鼠高消耗癥狀，但改善糖尿病大鼠體重的長期效應(yīng)要弱于磺酰胺類口服促胰島素分泌藥物?？紤]到體重變化僅僅代表糖尿病治療中的某一方面，因此，進一步觀察Brevinin-2Gub對糖尿病大鼠血糖和血胰島素水平的影響，對鑒定Brevinin-2Gub能否成為新一代糖尿病治療藥物，具有至關(guān)重要的意義。

本結(jié)果表明，Brevinin-2Gub可促進正常大鼠胰島素水平顯著上升，但對正常大鼠血糖水平卻無顯著影響，由此我們推測，Brevinin-2Gub降糖作用具有葡萄糖依賴性，只有在高血糖時候才具有顯著的降糖作用，因此具有較小的導(dǎo)致低血糖風(fēng)險。Brevinin-2Gub對造模糖尿病大鼠有降低血糖的作用，治療期間不同劑量的Brevinin-2Gub組的血糖均明顯低于僅糖尿病模型組，但降糖效應(yīng)仍低于臨床常用的磺酰脲類藥物格列吡脲，這與目前國內(nèi)外較為關(guān)注的糖尿病小肽治療藥物 exendin-4作用效果相近。

總之，本研究結(jié)果已證實了Brevinin-2Gub可有效降低糖尿病大鼠血糖水平，且具有較小產(chǎn)生低血糖風(fēng)險，可顯著減輕糖尿病大鼠消耗癥狀，并促進糖尿病大鼠體內(nèi)胰島素分泌，為其在糖尿病治療中進一步的開發(fā)利用，打下一定的基礎(chǔ)。

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