右美托咪定預(yù)處理對大鼠缺血再灌注肝臟TNF-α及ICAM-1表達的影響*

吳文峰 堯永華

在肝臟切除、肝移植等手術(shù)或合并肝硬化、失血性休克患者的手術(shù)中，肝缺血再灌注損傷是常見并發(fā)癥，引起臨床上廣泛關(guān)注[1]。肝臟缺血再灌注不但不能使肝組織細(xì)胞功能恢復(fù)，反而加重了肝臟功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，影響手術(shù)的預(yù)后。而藥物預(yù)處理（pharmacological preconditioning， PPC）操作簡單，只需要使用藥物無需其他特殊儀器設(shè)備，安全閾大，近年臨床上常用于肝臟缺血再灌注的研究[2]。Teoh等[3]研究表明，小劑量TNF-α預(yù)處理可明顯改善小鼠肝臟缺血再灌注損傷。右美托咪定作為一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，因其具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、鎮(zhèn)痛及交感神經(jīng)抑制等作用，近年常用于神經(jīng)、心臟、腎臟及肺的保護研究。但其對肝臟缺血再灌注的保護作用，目前仍未見有報道。本研究擬通過觀察右美托咪定對大鼠肝臟缺血再灌注后TNF-α和ICAM-1表達水平的影響，了解其減輕肝臟缺血再灌注損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠30只，體重150～220 g，年齡8～10周，由中山大學(xué)實驗動物中心提供。空調(diào)室內(nèi)飼養(yǎng)，室溫（20±2）℃，相對濕度保持在（55±10）%，自由進食水，術(shù)前12 h禁食，但不禁水。隨機分為3組：S組，IR組和Dex組，每組10只。

1.2 實驗處理 假手術(shù)組（S組）給予生理鹽水靜滴1 mL/（kg·h）30 min，間隔2 h后僅開腹；肝臟缺血再灌注組（IR組）給予生理鹽水靜滴1 mL/（kg·h）30 min，間隔2 h后行肝臟缺血1 h，再灌注4 h；右美托咪定預(yù)處理組（Dex組）給予Dex 5 μg/（kg·h） 30 min，間隔 2 h 后行肝臟缺血 1 h，再灌注4 h。

1.3 肝缺血再灌注模型的建立 腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥位固定，腹部脫毛，腹正中線開腹，游離肝臟周圍韌帶，顯露第一肝門，分離肝左葉及中葉的肝動脈、門靜脈、膽管分支，并使用無創(chuàng)血管鉗夾閉行肝臟部分缺血，以防止發(fā)生嚴(yán)重腸系膜淤血。缺血60 min后恢復(fù)再灌注，然后用絲線逐層關(guān)腹后置鼠籠中恢復(fù)，單籠飼養(yǎng)，禁食但不禁水：維持大鼠肛溫36～37 ℃。

1.4 血清ALT和AST測定 再灌注4 h后處死大鼠，留取腹主動脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，分離血清，分裝不同的Eppendorf管中，-20 ℃冰箱保存。應(yīng)用7600型全自動生化分析儀測定ALT和AST活性。

1.5 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測 各組于實驗結(jié)束后均取下大鼠肝臟，用10%的甲醛溶液固定24 h，75%酒精梯度脫水，然后石蠟包埋，切片做HE染色，用光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測TNF-α、ICAM-1的表達 用免疫組織化學(xué)兩步法將防脫石蠟切片染色。TNF-α濃度和ICAM-1濃度均為1：50，用PBS代替一抗作為陰性對照。陽性是細(xì)胞膜和胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。應(yīng)用CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，每組隨機選擇5張切片，每張切片隨機選擇5個高倍視野，檢測相應(yīng)測試區(qū)域的平均灰度及其相應(yīng)面積、陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均灰度及其相應(yīng)面積，根據(jù)申洪免疫組織化學(xué)染色定量方法求得陽性單位（Positive Unit， PU）[4]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清酶學(xué)檢測結(jié)果 IR組與Dex組大鼠血清AST、ALT酶水平與S組比較明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與IR組相比，Dex組ALT、AST酶水平的升高幅度顯著較小，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組ALT、AST含量變化（±s） IU/L

表1 各組ALT、AST含量變化（±s） IU/L

*與S組比較，P<0.01；△與IR組比較，P<0.05

組別 ALT AST S 組（n=10） 45±22 71±18 IR 組（n=10） 2856±842* 3564±789*Dex組（n=10） 2275±673*△ 2986±803*△

2.2 肝組織學(xué)變化 S組肝組織結(jié)構(gòu)清楚，無明顯壞死表現(xiàn)；IR組肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，網(wǎng)狀纖維支架塌陷，大片狀肝細(xì)胞變性壞死，空泡變性，胞漿疏松化，肝細(xì)胞索、肝竇充血腫脹，分界不清，大量炎性細(xì)胞浸潤；Dex組肝細(xì)胞損傷程度較IR組減輕，肝細(xì)胞輕微腫脹，肝小葉結(jié)構(gòu)尚清，肝細(xì)胞變性呈小灶狀壞死，有少量炎性細(xì)胞浸潤。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測 IR組與Dex組大鼠肝組織TNF-α及ICAM-1表達的PU值與S組相比明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；而Dex組與IR組相比明顯下降，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝組織TNF-α及ICAM-1表達的PU值比較（±s）

表2 各組大鼠肝組織TNF-α及ICAM-1表達的PU值比較（±s）

*與S組比較，P<0.01；△與IR組比較，P<0.05

組別 TNF-α ICAM-1 S 組（n=10） 3.21±0.4512 12.32±1.2676 IR 組（n=10） 18.93±1.2313* 23.02±1.2967*Dex組（n=10） 10.31±1.6213*△ 16.91±1.3431*△

3 討論

有研究表明，肝臟缺血后的再灌注能導(dǎo)致肝組織損傷進一步加重[5]。因此，減輕肝臟缺血再灌注損傷將有助于提高肝移植的成功率。Mustafa等[6]研究表明，右美托咪定能減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷。其可能機制：（1）紅細(xì)胞變形指數(shù)的下降；（2）抑制脂質(zhì)過氧化物的生成。而TNF-α和ICAM-1在右美托咪定保護大鼠肝臟缺血再灌注損傷機制中的作用，尚未有研究。

過往研究證明，TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，對肝臟缺血再灌注損傷的激發(fā)起到十分重要的作用[7]。TNF-α水平與肝臟損傷程度高度相關(guān)。肝臟缺血可導(dǎo)致TNF-α水平升高，后者通過活化炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡；其介導(dǎo)血栓素、白三烯和前列腺素等多種脂質(zhì)介質(zhì)的產(chǎn)生；誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生等多種途徑導(dǎo)致肝臟損傷。TNF-α不僅可直接導(dǎo)致肝臟損傷肝竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，而且能使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達顯著增加。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族的主要代表，介導(dǎo)黏附反應(yīng)的一個重要黏附分子，廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞表面。ICAM-1在正常情況下不表達或僅有微量表達，但在內(nèi)皮細(xì)胞損傷時，大量的炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子等誘導(dǎo)ICAM-1表達增加[8]。使中性粒細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的能力增強，導(dǎo)致肝臟微循環(huán)障礙。

本實驗通過檢測血清ALT和AST的水平來評價缺血再灌注損傷后肝臟損傷程度的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，Dex組和IR組大鼠的血清ALT水平明顯高于S組大鼠，而Dex組的升高幅度比IR組小。光學(xué)顯微鏡下，S組肝組織無明顯壞死表現(xiàn)，而Dex組肝臟損傷明顯比IR組輕。提示大鼠肝臟在右美托咪定預(yù)處理后對缺血再灌注損傷耐受性明顯增強，缺血再灌注造成的肝臟損傷明顯減輕。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，S組大鼠肝組織內(nèi)皮細(xì)胞僅有少量的TNF-α及ICAM-1表達；而IR組肝組織血竇內(nèi)皮細(xì)胞著色呈現(xiàn)強陽性，肝組織內(nèi)ICAM-1和TNF-α的表達明顯增加；Dex組ICAM-1和TNF-α的表達較IR組明顯減少，但與S組比較明顯增加，這與張錦英等[9]的研究結(jié)果相一致。肝臟缺血再灌注引起TNF-α的升高。TNF-α不但可直接導(dǎo)致肝臟內(nèi)皮細(xì)胞腫脹損傷，而且能導(dǎo)致ICAM-1表達水平升高。ICAM-1促使中性粒細(xì)胞活化以及與在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)黏附和聚集?；罨闹行粤＜?xì)胞釋放蛋白水解酶和氧自由基進一步加重肝細(xì)胞損害。李洋等[10]的研究也證實了這個觀點。ICAM-l通過與其配體LFA-1結(jié)合，啟動細(xì)胞黏附和活化，使中性粒細(xì)胞牢固地黏附于血管壁；ICAM-l還介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的遷移，使其通過內(nèi)皮細(xì)胞全層至肝實質(zhì)細(xì)胞，釋放出致肝細(xì)胞損傷的蛋白酶和反應(yīng)性氧原子等物質(zhì)[11]。

綜上所述，肝臟缺血再灌注損傷是包括炎性因子TNF-α激發(fā)，ICAM-1過度表達導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化及多種信號傳導(dǎo)分子參加的復(fù)雜損傷過程。本文中，右美托咪定預(yù)處理能減輕肝臟的缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制缺血再灌注肝細(xì)胞的TNF-α水平，調(diào)控ICAM-1表達有關(guān)。其具體機制，有待以后進一步研究。

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