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    低氧誘導(dǎo)因子基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

    2013-11-08 03:42哈小琴姜東紅鄧芝云董菊子彭俊華楊志華
    關(guān)鍵詞:腺病毒低氧質(zhì)粒

    哈小琴,姜東紅,鄧芝云,董菊子,趙 勇,彭俊華,楊志華

    (蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心,甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點實驗室,甘肅 蘭州 730050)

    低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是低氧時機(jī)體產(chǎn)生的一種重要的蛋白質(zhì)調(diào)控因子。在低氧的條件下,HIF-1 是誘導(dǎo)細(xì)胞由有氧代謝向無氧代謝轉(zhuǎn)換的重要因子[1],同時通過影響其他因子的表達(dá),直接參與缺氧組織內(nèi)血管生成的全過程[2]。HIF-1 在缺氧、缺血狀態(tài)下對組織細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸受到關(guān)注,目前有關(guān)利用HIF-1 防治低氧損傷的研究已開始起步。在缺氧條件下,HIF-1 參與機(jī)體對缺氧的反應(yīng),調(diào)控細(xì)胞氧平衡和誘導(dǎo)缺氧基因的表達(dá),迅速活化并誘導(dǎo)60 多種下游基因-低氧反應(yīng)元件(hypoxia-responsive element),其表達(dá)蛋白的功能包括了細(xì)胞存活、適應(yīng)無氧代謝、免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子生成、血管新生以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等各個方面。當(dāng)機(jī)體發(fā)生創(chuàng)傷、感染、休克、燒傷、外科手術(shù)、器官移植和處于高海拔地區(qū)時,以及其它一些嚴(yán)重疾病過程等應(yīng)激因素都會導(dǎo)致血流灌流不足,引起缺血、缺氧,加重疾病的發(fā)生發(fā)展。而HIF-1 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝模式,以無氧代謝適應(yīng)缺氧環(huán)境和誘導(dǎo)新生血管生成以增加局部供氧等方式保護(hù)組織細(xì)胞減少損害。然而,在機(jī)體發(fā)生損傷時,內(nèi)源的HIF-1 不足以滿足機(jī)體維持體內(nèi)環(huán)境的平衡,且其半衰期短,由此,我們設(shè)想通過基因治療的策略,以作為基因治療載體具有諸多優(yōu)點的腺病毒為載體,通過細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶HIF-1α 基因的重組腺病毒,從而滿足機(jī)體缺氧條件下對HIF-1 的需求,改善機(jī)體缺氧環(huán)境,并為進(jìn)一步研究利用HIF-1α 防治缺氧缺血性疾病提供實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 載體質(zhì)粒與細(xì)胞 pShuttle-CMV-EGFP 重組穿梭載體和pAdxsi 重組腺病毒骨架載體(北京諾賽基因組研究中心有限公司),人胚腎細(xì)胞系HEK293 細(xì)胞、ECV304 細(xì)胞(ATCC),DH5a 菌株。

    1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶KpnI、BamHI、I-CeuI、I-SceI、XhoI 及Phusion 超保真DNA 聚合酶(美國New England Biolabs 公司);T4 DNA連接酶(深圳晶美生物工程有限公司);CIP(Alkaline Phosphatase,Calf Intestinal)酶(美國Promega 公司);dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);引物合成及測序(北京諾賽基因組研究中心有限公司);質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA 純化試劑盒(柱離心型)、DNA 凝膠回收與純化試劑盒[威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司];Middle DNA MarkerⅠ(上海鼎國生物技術(shù)有限公司);DNA Marker DL2000 (日本TaKaRa 公司);DMEM(美國Sigma 公司);胎牛血清(Hyclone公司);胰酶(美國Sigma 公司);真核轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Gibco);培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿(康寧公司);氯化銫(美國Sigma);透析卡(Pierce 公司);人HIF-1 抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗人IgG 購自北京中山金橋生物有限公司。

    1.3 構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-HIF

    1.3.1 HIF-1α cDNA 擴(kuò)增獲取 低氧處理A549 細(xì)胞后提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(模板),依據(jù)基因庫公布的HIF-1α cDNA 設(shè)計引物,上游引物含 KpnI 酶切位點:CGGGGTACCATGGAGGGCGCCGGCGGC,下 游引物含BamHI 位點:CGCGGATCCTCAGTTAA CTTGATCCAA;用Phusion 超高保真DNA 聚合酶梯度擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)體系:模板1.0μL,HIFKpnI-F(10μmol/L)2.5μL,HIF-BamHI-R(10μmol/L)2.5μL,dNTP(each 10μmol/L)1μL,5×Phusion HF Buffer 10μL,Phusion HF DNA ploymerase(2 U/μL)0.5μL,ddH2O 補(bǔ)齊至50μL;PCR 擴(kuò)增程序:95℃5 min,95℃30 s,65℃30 s,72℃90 s,10個循環(huán),每個循環(huán)降0.5℃,95℃30 s,55℃30 s,72℃90 s,20個循環(huán),72℃10 min。PCR 結(jié)束后加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下切下目的片段,用DNA 凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)回收。將回收后的PCR 片段進(jìn)行KpnI/BamHI 酶切處理,酶切結(jié)束后,用DNA 純化試劑盒(柱離心型)回收得到含有相應(yīng)粘性末端(KpnI/BamHI)的HIF-1α cDNA 片段。

    1.3.2 酶切穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-EGFP 將pShuttle-CMV-EGFP 穿梭載體用KpnI/BamHI酶切,CIP 去磷酸化處理,酶切完成后加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下切下目的片段,用DNA 凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)回收5.1 kb 載體片段。

    1.3.3 提取重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-HIF將處理好的載體片段(pShuttle-CMV-EGFP KpnI/BamHI)和HIF-1α 插入片段(HIF-1α cDNA KpnI/BamHI)用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接,取3μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5a 菌株,涂布到卡那抗性固體LB 培養(yǎng)基平皿,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落,接種到卡那抗性液體培養(yǎng)基中,搖床中37℃300 r/min 振蕩培養(yǎng),提取質(zhì)粒后雙酶切(KpnI/BamHI)及測序鑒定。

    1.4 構(gòu)建重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxsi-GFPHIF

    1.4.1 酶切重組腺病毒骨架載體pAdxsi 用I-CeuI 和I-SceI 雙酶切處理pAdxsi 載體,并做CIP 去磷酸化處理,待反應(yīng)結(jié)束后酶切反應(yīng)體系中加入10%SDS 75℃滅活10 min,用乙醇沉淀法回收載體。

    1.4.2 鑒定重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxsi-GFPHIF 用I-CeuI 和I-SceI 雙酶切處理插入片段pShuttle-GFP-HIF,酶切完成后加樣至1%的瓊脂糖凝膠,電泳回收純化目的片段。將上述處理好的載體片段和插入片段用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接,取3μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5a 菌株,涂布到氨芐抗性LB 培養(yǎng)基平皿,挑取單克隆菌落接種到氨芐抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),小提質(zhì)粒后用XhoI 酶切電泳鑒定。

    1.5 純化重組腺病毒

    1.5.1 包裝與鑒定重組腺病毒 將293 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中,每孔5×105個,置37℃含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將鑒定正確的pAdxsi-GFP-HIF 用PacI 限制性內(nèi)切酶線性化,轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞換新鮮培養(yǎng)基,用Lipofectamine2000 脂質(zhì)體按其所附說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每天觀察細(xì)胞出毒跡象,待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒。反復(fù)凍融3次后,800×g 離心5 min,收集含病毒的上清液即為毒種。用PCR 法鑒定腺病毒是否攜帶目的基因。

    1.5.2 純化重組腺病毒 用293 細(xì)胞大量擴(kuò)增病毒。采用氯化銫不連續(xù)密度梯度離心法純化病毒。測定OD260 并按照VP/ml=OD260×1.1×1012,計算得到每毫升制品中的病毒顆粒數(shù)(VP/ml),測定OD260/OD280 比值檢測病毒的純度。用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50 值)法測定病毒制品的活性后-80℃保存。

    1.6 檢測內(nèi)皮細(xì)胞中重組腺病毒pAdxsi-GFPHIF 將生長旺盛的ECV304 細(xì)胞以1×106個/孔接種于6 孔板,24 h 后棄去培養(yǎng)上清液,以前期工作中得出的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI=100 pfu/cell)轉(zhuǎn)染pAdxsi-GFP-HIF 病毒,轉(zhuǎn)染24 h 和48 h 后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染48 h ELISA 法檢測培養(yǎng)上清液中HIF-1 蛋白含量。

    2 結(jié)果

    2.1 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-HIF 的鑒定經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟,將HIF-1α cDNA 克隆至穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-EGFP 中,獲得重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-HIF。重組質(zhì)粒用KpnI/BamHI 雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1),可見大小約2.5 kb 及5.1 kb 的兩個基因片段,分別為pShuttle-GFP 質(zhì)粒和HIF-1α。測序結(jié)果顯示與基因庫中序列一致。表明含HIF-1α cDNA 的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFPHIF 已成功構(gòu)建。

    2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-HIF 的鑒定經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟,將穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-HIF 中的GFP-HIF 克隆至pAdxsi腺病毒骨架載體上,獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-HIF。根據(jù)重組后腺病毒載體的序列分析攜帶目的基因表達(dá)框的陽性克隆被XhoI 酶切后由8 條帶組成:14.50 kb、11.70 kb、2.66 kb、2.60 kb、2.48 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.60 kb(圖2),其中2.66 kb/2.60 kb 和2.48 kb/2.47 kb 可能重疊將無法區(qū)分。沒有重組目的基因的腺病毒空載體由以下6 條帶組成:14.00 kb、11.80 kb、4.00 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.66 kb(圖3)。

    2.3 重組腺病毒pAdxsi-GFP-HIF 的效價 用Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體將pAdxsi-GFP-HIF轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞10 d 后,觀察到細(xì)胞變大變圓,呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng),并開始出現(xiàn)中間區(qū)域細(xì)胞變圓、漂浮、邊緣細(xì)胞不規(guī)則收縮的噬斑。多次感染后獲得大量病毒,病毒顆粒數(shù)為9.46×1011/mL,OD260/OD280 比值為1.33,病毒的感染效價為3.38×1010pfu/mL。

    2.4 重組腺病毒pAdxsi-GFP-HIF 在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá) 將純化的重組腺病毒pAdxsi-GFPHIF 轉(zhuǎn)染ECV304 細(xì)胞24 h 后,在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)(圖4A),48 h 時熒光更強(qiáng)(圖4B);轉(zhuǎn)染48 h 培養(yǎng)上清液中HIF-1 蛋白表達(dá)水平為(48.93±3.86)ng/mL。

    圖1 pShuttle-GFP-HIF KpnI/BamHI 酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Results of pShuttle-GFPHIF KpnI/BamHI digested identification

    圖2 pAdxsi-GFP-HIF XhoI 酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Results of pAdxsi-GFPHIF XhoI digested identification

    圖3 pAdxsi 空載體XhoI酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Results of pAdxsi empty vector XhoI digested identification

    圖4 重組腺病毒pAdxsi-GFP-HIF 轉(zhuǎn)染ECV304 細(xì)胞后熒光顯微鏡檢測結(jié)果Fig.4 ECV304 cells transfected with recombinant adenovirus pAdxsi-GFP-HIF were examined by experion system

    3 討論

    1992年Semenza[3]在人的Hep 3B 細(xì)胞株的核提取物中發(fā)現(xiàn)一種蛋白質(zhì),這種蛋白能特異性地結(jié)合于紅細(xì)胞生成素基因增強(qiáng)子的寡核苷酸序列,后來發(fā)現(xiàn)該蛋白可調(diào)控多種低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄,參與低氧反應(yīng)信號傳導(dǎo)過程,故命名為HIF-1[4]。隨著對其研究的不斷深入,在實驗中發(fā)現(xiàn)其與缺血/低氧狀態(tài)下機(jī)體的各種應(yīng)答機(jī)制關(guān)系密切[5]。

    HIF-1 主要以異源二聚體的形式存在,其中HIF-1α 是調(diào)節(jié)亞基,對低氧非常敏感,受氧濃度的影響表達(dá)差異較大,所以在功能調(diào)控方面起關(guān)鍵作用,決定HIF-1 的活性[6]。在氧濃度低于6% 時(相當(dāng)于氧分壓在46 mmHg),HIF-1α 成倍增加,迅速達(dá)到最大值,并與HIF-1β 形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的HIF-1 分子。HIF-1α 隨著缺氧時間的延長而被大量激活。HIF-1α 屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白,且含有PAS 結(jié)構(gòu)域,為bHLH-PAS 超家族成員,在機(jī)體組織缺氧的狀態(tài)下表達(dá)增加,促進(jìn)血管生成[7]。HIF-1α 可與含有低氧反應(yīng)元件和順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的靶基因結(jié)合,從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。迄今發(fā)現(xiàn)HIF-1α 的靶基因有幾十個,分別在器官、組織、細(xì)胞水平的低氧適應(yīng)反應(yīng)過程中起重要作用,血管生成是組織適應(yīng)低氧環(huán)境的一個重要方面,與HIF-1α 高度相關(guān)[8]。HIF-1α 對血管生成的影響主要是通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)來完成的[9]。在HIF-1 的刺激下VEGF 及其受體表達(dá)增加,VEGF 對缺血缺氧組織的保護(hù)作用主要通過以下幾個途徑:(1)VEGF 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成,改善局部血供[9]。同時VEGF 還能在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá),抑制凋亡蛋白caspase-3 的表達(dá),維持內(nèi)皮細(xì)胞的生存[10]。此外,VEGF 還能刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移,防止血管再狹窄的發(fā)生[11]。(2)VEGF 增加血管尤其是微小血管通透性的作用較強(qiáng),使血漿大分子外滲沉積在血管外的基質(zhì)中,為細(xì)胞的生長和新生毛細(xì)管的建立提供營養(yǎng)[12]。基于此,若在缺血低氧組織局部給予HIF-1α 以防治其損傷具有非常重要的意義。

    由于直接應(yīng)用HIF-1α 蛋白制劑存在蛋白半衰期短,需要大量、反復(fù)應(yīng)用才能維持局部較高的HIF-1α 濃度的弊端,且生產(chǎn)符合臨床用蛋白制劑工藝復(fù)雜、成本較高,所以本實驗采用基因治療的策略,將HIF-1α 基因克隆至腺病毒載體中,單次應(yīng)用重組腺病毒后使局部轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為一“微型藥物工廠”可持續(xù)一定時間分泌表達(dá)HIF-1α 活性蛋白,一次轉(zhuǎn)染后在缺氧缺血的局部持續(xù)一段時間發(fā)揮HIF-1α 作用。

    本研究中構(gòu)建HIF-1α 基因轉(zhuǎn)移載體時選用腺病毒載體,原因是腺病毒載體具有感染細(xì)胞效率高、宿主范圍廣、不整合入細(xì)胞基因組、可插入片段容量大、容易制備高效價病毒、遺傳毒性較低、細(xì)胞毒性較低、免疫原性弱等優(yōu)勢[13],且已被廣泛用于基因治療研究和臨床試驗中[14-15]。本研究成功構(gòu)建了攜帶HIF-1α 基因的重組腺病毒pAdxsi-GFP-HIF,其擴(kuò)增、純化后的重組病毒純度好、效價高,以100 MOI 轉(zhuǎn)染ECV304 細(xì)胞后其轉(zhuǎn)染效率及目的基因的蛋白表達(dá)水平均較高,因此可在缺血缺氧組織局部,具有潛在的應(yīng)用前景。

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