不同藥物誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型的差異性研究

胡 琳，張華丹，陳亞天，華 男，曾玲暉

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015)

癲癇(Epilepsy)是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，患者常表現(xiàn)為突然、短暫的運動、感覺、意識或精神等異常。反復(fù)的癇性發(fā)作嚴重影響患者生活和心理，甚至損害認知功能。資料顯示，癲癇患者的生活質(zhì)量明顯低于正常人群，且低于其他慢性疾病患者，如高血壓、糖尿病等。迄今為止，癲癇的發(fā)病機制仍不清楚，其治療主要依靠藥物和手術(shù)，而且抗癲癇藥物通常需長期服用，且有明顯的副作用［1-3］。目前，與癲癇相關(guān)的發(fā)病機理及藥物治療研究仍主要依靠動物模型。另外，由于癲癇的發(fā)作沒有預(yù)見性，發(fā)作程度也不能人為控制，從而給研究癲癇帶來困難。因此建立實驗性動物癲癇模型，對于篩選、評價抗癲癇藥物的作用，具有重要意義。

匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮是目前常用的幾種化學(xué)致癇藥物［4-7］。以往報道中模型動物的選取基本以大鼠和近交系小鼠多見，采用ICR 小鼠的研究較少，而ICR 小鼠價格低廉。明確ICR 小鼠對常見化學(xué)致癇藥物的反應(yīng)性，在抗癲癇藥物篩選和毒理學(xué)研究等方面有良好的應(yīng)用前景。本研究在ICR 小鼠分別腹腔注射上述3 種藥物后，觀察癲癇急性發(fā)作情況，包括潛伏期、癲癇發(fā)作級別、以及死亡率等，并通過對比3 種模型中興奮性神經(jīng)元及苔蘚纖維發(fā)芽程度，探討ICR 品系小鼠對3 種藥物誘導(dǎo)的癲癇模型反應(yīng)性的差異。

1 材料和方法

1.1 實驗動物以及試劑年齡為6 周的雄性ICR 小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司(動物許可證號:SYXK(滬)2012-0002)。動物使用嚴格參照浙江大學(xué)動物管理委員會的規(guī)定執(zhí)行。匹羅卡品、紅藻氨酸、氫溴酸東莨菪堿和阿拉伯膠軍鉤子Sigma 公司，USA;地西泮購自江西制藥有限公司;其他試劑均為市售分析純。

1.2 實驗分組及處理 按照隨機區(qū)組法將動物按體重分成若干區(qū)組，再給每個區(qū)組中的動物編號，利用隨機數(shù)表法分配到各組。由于預(yù)實驗中各組死亡率不同，正式實驗中采用分批的方式確保可用于后續(xù)實驗的動物數(shù)一致。實驗小鼠分為匹羅卡品組(pilocarpine，Pilo)、紅藻氨酸組(kainic acid，KA)、戊四氮組(pentylenetetrazol，PTZ)和 對 照組(control，Cont)。匹羅卡品組:ICR 小鼠先腹腔注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，30 min 后再腹腔注射鹽酸匹羅卡品30 mg/kg。紅藻氨酸組:ICR 小鼠腹腔注射紅藻氨酸30 mg/kg。戊四氮組:ICR 小鼠腹腔注射戊四氮40 mg/kg，10 min 后20 mg/kg，之后每10 min 腹腔注射10 mg/kg，到出現(xiàn)Ⅳ-Ⅴ級癲癇發(fā)作。對照組:僅注射生理鹽水。所有動物在一次SE 發(fā)作2 h 后，用安定(10 ml/kg)終止其發(fā)作。不同實驗的樣本量根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果從效應(yīng)強度和生物差異來確定。

癲癇的分級參照1972年Racine［8］制定的標(biāo)準(zhǔn):一級:靜止不動伴隨有嘴部/面部運動;二級:點頭及落水狗樣抖動;三級:前肢陣攣;四級:站立及雙側(cè)前肢陣攣;五級:持續(xù)站立及跌倒;六級:狂奔及尖叫。

1.3 Fluro-Jade B(FJB)染色 在SE 造模后7 d，根據(jù)發(fā)作級別和持續(xù)時間，各組選取小鼠8只腹腔注射10%的水合氯醛，待完全麻醉后，分別用PBS 和4%多聚甲醛(PFA)進行心臟灌流。取出腦組織后，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定過夜，再轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中置于4℃冰箱中至腦組織沉入底部。

FJB 染色參照我們以前發(fā)表的文獻［9］:切片用PBS 沖洗后，先用1%NaOH/80%酒精溶液浸泡5 min，然后依次在70%酒精和蒸餾水里各浸泡2 min。經(jīng)0.06%的高錳酸鉀溶液浸泡10 min(室溫，搖床)，切片稍經(jīng)水洗后，置于0.1%醋酸配置的0.001%FJB 溶液中浸染20 min(避光，搖床)。封片后結(jié)果在顯微鏡下觀察。

1.4 Timm 染色 在SE 造模后28 d，根據(jù)發(fā)作級別和持續(xù)時間，各組選取小鼠8 只腹腔注射10%的水合氯醛，待完全麻醉后，依次用生理鹽水、1%硫化鈉、生理鹽水、4%多聚甲醛(3 min)進行心臟灌流固定。腦組織連續(xù)切片后，在含銀的緩沖液(10%阿拉伯膠60 ml，檸檬酸緩沖液10 ml，5.67%對二苯酚30 ml，2%硝酸銀2 ml)中避光孵育60～80 min，切片在蒸餾水洗10 min 后，脫水后封片，在顯微鏡下觀測齒狀回分子細胞層苔蘚纖維發(fā)芽狀況。

苔蘚纖維出芽評分標(biāo)準(zhǔn)參照Buckmaster文獻［10］:0 分:未見Timm 顆粒;1 分:偶見散在的片狀分布的Timm 顆粒;2 分:較多片狀分布的Timm 顆粒;3 分:Timm 顆粒接近連續(xù)分布;4分:濃密的Timm 顆粒帶，連續(xù)或接近連續(xù)分布;5 分:濃密、層帶狀Timm 顆粒連續(xù)分布。

1.5 錄像監(jiān)測 在SE 后第2天，將待觀察小鼠放入小鼠專用錄像籠中，每天持續(xù)記錄10 小時。觀看視頻，記錄小鼠每日發(fā)生自發(fā)性癲癇的次數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 除造模成功率外，其余數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行檢驗。造模成功率的比較采用卡方檢驗，癲癇發(fā)生潛伏期、癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)生級別的比較采用one-way ANOVA 及S-N-K 分析，神經(jīng)細胞死亡及苔蘚纖維發(fā)芽采用one-way ANOVA 及Dunnetts 分析。P＜0.05 認為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物誘導(dǎo)的急性癇性發(fā)作的表現(xiàn)在匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮給藥后，分別觀察各組癲癇發(fā)生的癥狀、潛伏期、發(fā)作級別以及死亡率。注射紅藻氨酸后，小鼠逐漸出現(xiàn)凝視、點頭、面部及頭部抽搐、全身肌陣攣、跌倒，大、小便失禁及流涎，最終發(fā)生全身強直-陣攣性發(fā)作、癲癇持續(xù)狀態(tài)，其癲癇發(fā)作狀態(tài)有逐漸由低級向高級發(fā)展的特點。如表1 所示，紅藻氨酸組小鼠潛伏期最長，癲癇發(fā)作較穩(wěn)定，造模成功率在3組中最高。匹羅卡品組小鼠潛伏期較長，癲癇發(fā)作等級較高，其死亡率相對于其他兩組高。注射匹羅卡品后，小鼠初期表現(xiàn)為運動不能、面部抽搐、單肢陣攣、濕狗樣抖動、點頭和平衡失調(diào)等，之后很快出現(xiàn)肢體強直陣攣伴有站立及前肢陣攣等邊緣系統(tǒng)運動性發(fā)作表現(xiàn)，最后大多數(shù)小鼠出現(xiàn)全身強直——陣攣發(fā)作伴有站立、跌倒，反復(fù)出現(xiàn)呈癲癇持續(xù)狀態(tài)。戊四氮組小鼠潛伏期極短，癲癇發(fā)作等級非常高，死亡率也較高。一般在注射戊四氮后的1min 內(nèi)，小鼠即出現(xiàn)軀體游走性痙攣、臀部上翹等表現(xiàn)，隨后出現(xiàn)瞼肌陣攣、凝視、點頭運動、尾巴上翹，繼之雙前肢抬起陣攣或后肢伸展、頭向左或右扭動，隨后出現(xiàn)四肢抽搐;達到V 級以上發(fā)作的小鼠則表現(xiàn)為狂奔嘶叫、全身強直-陣攣性發(fā)作，同時伴有全身青紫。在之后觀察的2 h 內(nèi)，小鼠仍然會間歇性出現(xiàn)大于等于4 級的癲癇發(fā)作。

表1 不同藥物誘發(fā)的小鼠急性癇性發(fā)作情況Table 1 Comparison of seizure latency，severity and success rate of modeling

2.2 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型對神經(jīng)元死亡的影響 小鼠急性癇性發(fā)作后7 d，不同組別腦組織切片經(jīng)FJB 染色。如圖1 所示，對照組、匹羅卡品組、紅藻氨酸組和戊四氮組小鼠腦組織切片海馬CA1 區(qū)均未見到明顯的神經(jīng)元細胞死亡。同樣，對照組、匹羅卡品組、紅藻氨酸組和戊四氮組小鼠腦組織切片在海馬CA3 區(qū)、DG 區(qū)也均未見到明顯的神經(jīng)元細胞死亡(數(shù)據(jù)未出示)。

圖1 不同藥物誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型均未出現(xiàn)神經(jīng)細胞死亡Fig.1 No cell death was detected in different drug-induced seizure model

2.3 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型小鼠中苔蘚纖維發(fā)芽程度的不同 苔蘚纖維發(fā)芽是自發(fā)性癲癇的病理表現(xiàn)之一。為檢測ICR 小鼠不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型中苔蘚纖維發(fā)芽有無不同，在急性癇性發(fā)作后第28天小鼠灌流取腦行Timm 染色。如圖2 所示，匹羅卡品組(圖2B)和紅藻氨酸組(圖2C)可見明顯苔蘚纖維發(fā)芽，但戊四氮組(圖2D)與對照組相似，未見明顯苔蘚纖維發(fā)芽。對四組小鼠Timm 染色進行評分的結(jié)果見表2，與對照組相比，匹羅卡品組和紅藻氨酸組均顯著增高(P＜0.001)。

圖2 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型中苔蘚纖維發(fā)芽的差異Fig.2 Variability of mossy fiber sprouting in different drug-induced seizure model

表2 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇小鼠模型中苔蘚纖維發(fā)芽評分情況Table 2 Timm's score in different drug-induced seizure model

2.4 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型小鼠自發(fā)性癲癇的發(fā)作情況 在成功誘發(fā)急性癇性發(fā)作后次日，對小鼠每日采用錄像記錄，連續(xù)4 周，每組14 只。對照組小鼠和戊四氮組小鼠未觀察到自發(fā)性癲癇發(fā)作，匹羅卡品組小鼠有8 只發(fā)生自發(fā)性癲癇，發(fā)生率為57.1%;紅藻氨酸組小鼠有6 只發(fā)生自發(fā)性癲癇，發(fā)生率為42.9%。對小鼠逐周的癲癇發(fā)生次數(shù)進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移匹羅卡品和紅藻氨酸模型組癲癇的發(fā)作頻率均升高(圖3)。

圖3 自發(fā)性癲癇發(fā)生頻率隨時間的推移而增加Fig.3 The frequency of spontaneous seizure increased with time

3 討論

不同化學(xué)藥物誘導(dǎo)的癲癇模擬臨床不同的癲癇類型，匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮是目前最常用的幾種癲癇模型的化學(xué)藥物［4-7］。既往的研究以SD 大鼠和C57BL6 小鼠為研究對象居多，然而SD 大鼠和C57BL6 價格是ICR 小鼠的4～6 倍。本研究系統(tǒng)觀察了ICR 小鼠對匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮誘發(fā)的癲癇的行為學(xué)特征、神經(jīng)元丟失，苔蘚纖維出芽及自發(fā)性癲癇的發(fā)生狀況。結(jié)果顯示，ICR 小鼠對三種致癇藥物的反應(yīng)與SD 大鼠相似:匹羅卡品和紅藻氨酸單次注射即能誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)，在終止發(fā)作后一個月內(nèi)半數(shù)左右的動物會出現(xiàn)反復(fù)自發(fā)性發(fā)作，其表現(xiàn)類似于人類慢性顳葉癲癇;與匹羅卡品組相比，紅藻氨酸階段性明顯、行為學(xué)表現(xiàn)規(guī)律、穩(wěn)定、死亡率低。戊四唑閾下劑量反復(fù)注射，經(jīng)過多次刺激，半數(shù)以上的ICR 小鼠能夠成功點燃，但在其后的一個月內(nèi)未觀測到自發(fā)性癲癇發(fā)生，表現(xiàn)類似于人類急性失神性癲癇發(fā)作。因此，作為癲癇發(fā)病機制研究和藥物篩選，ICR 小鼠不失為一個既經(jīng)濟又有效的品系。

不同品系的小鼠對化學(xué)藥物誘導(dǎo)的癲癇呈現(xiàn)不同的反應(yīng)性［11-13］。比如紅藻氨酸誘發(fā)的癇性發(fā)作在C57BL6 品系的小鼠不易發(fā)生神經(jīng)元凋亡和苔蘚纖維出芽，而FBV 品系則容易出現(xiàn)細胞毒性。而在匹羅卡品誘發(fā)的急性癇性發(fā)作中，C57BL6 則出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元死亡和自發(fā)性癲癇發(fā)作。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)匹羅卡品和紅藻氨酸誘導(dǎo)急性癇性發(fā)作2 h 后，ICR 小鼠表現(xiàn)為明顯的苔蘚纖維發(fā)芽和自發(fā)性癲癇發(fā)生，但未見神經(jīng)元細胞死亡。不同品系的動物對不同癲癇藥物反應(yīng)性的差異與動物的遺傳特性以及不同致癇藥物的藥理作用及毒理作用機制高度相關(guān)。

神經(jīng)元死亡［14-15］和苔蘚纖維發(fā)芽［16-17］是癲癇持續(xù)狀態(tài)誘發(fā)的典型病理表現(xiàn)，從而導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路興奮性增高和自發(fā)性癲癇的發(fā)生。本研究中發(fā)現(xiàn)匹羅卡品和紅藻氨酸誘發(fā)急性癇性發(fā)作2 h 后，在ICR 小鼠能檢測到明顯苔蘚纖維發(fā)芽和自發(fā)性癲癇發(fā)作，但并沒有觀測到神經(jīng)元死亡，提示自發(fā)性癲癇發(fā)生可能與苔蘚纖維發(fā)芽直接相關(guān)，與以往相關(guān)報道一致［18］，具體機制尚待進一步研究。

由于樣本量大，本研究中對自發(fā)性癲癇的觀測采用每日錄像記錄10 h 的不連續(xù)方式，與連續(xù)腦電圖記錄相比，數(shù)據(jù)可能存在一定偏差。且僅觀測到造模后4 周，有的小鼠初始腦損傷的潛伏期長，可能在4 周后才開始出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作，因此數(shù)據(jù)可能有遺漏。但從本研究結(jié)果仍然可看出，在匹羅卡品和紅藻氨酸誘發(fā)急性癇性發(fā)作后，半數(shù)左右的ICR 小鼠呈現(xiàn)自發(fā)性癲癇的發(fā)作，且發(fā)作頻率隨著時間的推移呈上升趨勢。

總之，本研究結(jié)果表明，ICR 小鼠在匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮給藥后均顯示出與大鼠或C57BL6 小鼠相似的急性癇性發(fā)作。匹羅卡品和紅藻氨酸誘發(fā)ICR 小時2 小時的急性癲癇發(fā)作后未見明顯細胞死亡，但苔蘚纖維發(fā)芽明顯，可能與自發(fā)性癲癇的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。

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