全基因組測(cè)序后質(zhì)粒的組裝與鑒定研究進(jìn)展*

茍秋鳳，代富英，曹 康，謝擁軍，潘 渠

成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室(成都 610500)

全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)從1977年發(fā)展至今，已成為一種快速、低成本獲取生物體全基因組的方法[1]。WGS可發(fā)現(xiàn)基因組變異，在微生物的分類鑒定中應(yīng)用廣泛[2]。WGS經(jīng)歷了三代技術(shù)革新，二代測(cè)序和三代測(cè)序的結(jié)合已成為目前最廣泛的雜交測(cè)序方法[3-4]。雜交測(cè)序一方面使用長(zhǎng)讀長(zhǎng)跨越重復(fù)序列或缺口，另一方面使用短讀長(zhǎng)糾正測(cè)序中錯(cuò)誤的堿基[5]。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中完成WGS的菌株越來(lái)越多，用傳統(tǒng)的DNA文庫(kù)或PCR擴(kuò)增的方法無(wú)法獲得的質(zhì)?？捎蒞GS數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，但組裝質(zhì)粒的正確性和完整性需要進(jìn)一步鑒定和分析。從WGS中準(zhǔn)確識(shí)別染色體序列和質(zhì)粒序列是質(zhì)粒鑒定分析的先決條件[6]。WGS可獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒序列，但很多組裝質(zhì)粒并不一定真實(shí)存在，質(zhì)粒的組裝仍存在較多問(wèn)題，且尚未被解決，需改良WGS后的組裝。本文對(duì)WGS技術(shù)的發(fā)展、WGS后質(zhì)粒的組裝、質(zhì)粒的鑒定及質(zhì)粒組裝中存在的問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 WGS的發(fā)展

第一代測(cè)序技術(shù)以Sanger等[1]提出的鏈終止法及Maxam等[7]提出的鏈降解法為標(biāo)志。Sanger測(cè)序使用4種帶有熒光標(biāo)記的2′, 3′-二脫氧胸腺嘧啶三磷酸(2′, 3′-dideoxythymidine-5′-triphosphate，ddTTP)。在DNA合成中，因ddTTP在2′, 3′上不含羥基不能形成磷酸二脂鍵，特定在含胸苷酸的位置終止，阻止鏈的延伸；在DNA反應(yīng)體系中分別加入4種帶有同位素?zé)晒鈽?biāo)記的ddTTP，在凝膠電泳顯影后，其條帶的位置可確定DNA序列[8]。1977年噬菌體phiX174使用Sanger測(cè)序法完成了基因組測(cè)序[8]。Sanger測(cè)序依賴于使用DNA聚合酶，在受控條件下轉(zhuǎn)錄DNA的特定區(qū)域，需要模板、引物及電泳分離產(chǎn)品，其特點(diǎn)為通量低，不適用于長(zhǎng)片段測(cè)序。

第二代測(cè)序也稱下一代測(cè)序，以瑞氏Roche公司的454測(cè)序、美國(guó)Illumina公司的Solexa/HiSeq測(cè)序和美國(guó)ABI公司的SOLiD系統(tǒng)高通量測(cè)序?yàn)闃?biāo)志[9]。Illumina測(cè)序技術(shù)采用合成測(cè)序技術(shù)，將帶有固定接頭的文庫(kù)變性為單鏈并移植到流動(dòng)槽上，然后進(jìn)行橋接擴(kuò)增，形成含有克隆DNA片段的簇。測(cè)序前文庫(kù)借助線性化酶連接成單鏈，然后用含有不同熒光、可移除保護(hù)基團(tuán)的4種堿基補(bǔ)充模板，用電荷耦合器捕獲信號(hào)、分析數(shù)據(jù)[9]。Illumina測(cè)序技術(shù)主導(dǎo)第二代測(cè)序市場(chǎng)，測(cè)序速度快、成本低，其讀長(zhǎng)正確率高達(dá)99.9%，但長(zhǎng)度只有100～300 bp[3,10-11]，導(dǎo)致許多基因組被分割成數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)讀長(zhǎng)；而基因組包含許多長(zhǎng)讀長(zhǎng)的重復(fù)序列，短讀長(zhǎng)導(dǎo)致片段化組裝或缺口，無(wú)法正確測(cè)重復(fù)序列，組裝的連續(xù)性較差[4,11-12]。二代測(cè)序依賴于PCR，而PCR擴(kuò)增GC%極值區(qū)的效率低[11]，準(zhǔn)確測(cè)序GC%極值區(qū)難度較大。

第三代測(cè)序以美國(guó)PacBio公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(single-molecule real-time sequencing，SMRT)和納米孔測(cè)序(oxford nanopore technologies sequencing，ONT)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)為標(biāo)志[13]。SMRT對(duì)單個(gè)DNA分子實(shí)時(shí)測(cè)序，通過(guò)SMRTbell(一種閉合的單鏈環(huán)狀DNA)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接模板DNA,進(jìn)入到芯片SMRTcell的最小測(cè)序單元ZMW中。ZMW底部固定的聚合酶與SMRTbell結(jié)合并開始復(fù)制，SMRTcell中4種不同熒光標(biāo)記的核苷酸被結(jié)合時(shí)產(chǎn)生可識(shí)別的光脈沖數(shù)據(jù)即可進(jìn)行分析[14]。SMRT比大多數(shù)測(cè)序方法更快，平均讀長(zhǎng)>10 kb，但單次測(cè)序堿基錯(cuò)誤率較高[15]，通過(guò)多次測(cè)序可降低錯(cuò)誤率，但受聚合酶活性限制，讀長(zhǎng)和測(cè)序次數(shù)相互影響。SMRT吞吐量較低，1個(gè)SMRTcell中有150 000個(gè)ZMW，但只有35 000～70 000個(gè)ZMW可成功產(chǎn)生讀長(zhǎng)。SMRT體積龐大，需要大量的初始投資，適用于大型測(cè)序中心，因測(cè)序成本較高導(dǎo)致使用受限[4, 14]。ONT在流動(dòng)槽中進(jìn)行，流動(dòng)槽中的2個(gè)離子溶液被含有納米孔的膜隔開，當(dāng)DNA經(jīng)過(guò)納米孔時(shí),通過(guò)發(fā)生的電導(dǎo)率變化來(lái)識(shí)別DNA堿基，最后利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，完成數(shù)據(jù)采集和分析[13, 16]。ONT通量高且快速，讀長(zhǎng)的長(zhǎng)度不受技術(shù)本身限制，與受測(cè)DNA分子長(zhǎng)度有關(guān)，如果DNA質(zhì)量足夠，可獲得高達(dá)1 Mb的讀長(zhǎng)。ONT的讀長(zhǎng)錯(cuò)誤率比SMRT高[4, 11]，但新的文庫(kù)制備技術(shù)和堿基識(shí)別算法的錯(cuò)誤率可降至12%[17]。ONT體積小且便宜，初始投資低，可在預(yù)防疾控中心進(jìn)行快速測(cè)序，便于診斷[4]。SMRT和ONT的共同特征為產(chǎn)生長(zhǎng)讀長(zhǎng)，不需要引物和PCR擴(kuò)增，減少或消除PCR擴(kuò)增帶來(lái)的測(cè)序偏差。長(zhǎng)讀長(zhǎng)可跨過(guò)短讀長(zhǎng)在重復(fù)序列和高GC%含量區(qū)產(chǎn)生缺口[18]，提高基因組裝配的連續(xù)性，但由于較高的堿基錯(cuò)誤率，需要在組裝前或組裝后使用短讀長(zhǎng)校正組裝[19]。

生物體通過(guò)WGS可獲得全部基因組信息。Pareek等[20-21]對(duì)人類和模式生物體進(jìn)行WGS分析發(fā)現(xiàn)，基因組有多種變異類型，例如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)、拷貝數(shù)變異、復(fù)合物重排等。WGS可監(jiān)測(cè)癌癥基因突變，探索其功能或臨床意義[22-23]。微生物的WGS結(jié)果通過(guò)與已測(cè)菌株的序列比對(duì)，可發(fā)現(xiàn)新生物或鑒定特定的細(xì)菌生物。宏基因組測(cè)序也是一種快速檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)新物種的測(cè)序方法，其基因組數(shù)據(jù)來(lái)自同一物種，不是單一的菌株，不需要對(duì)微生物分離和純化。已測(cè)序的宏基因組中包含許多未被鑒定的質(zhì)粒序列，從宏基因組數(shù)據(jù)中組裝質(zhì)粒計(jì)算量大且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力[24]。細(xì)菌病原體的WGS具有流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的潛力[25]。

2 WGS后質(zhì)粒的組裝

WGS后質(zhì)粒的組裝程序根據(jù)貪婪法、重疊布局共識(shí)(overlap-layout-consensus，OLC)、de Bruijn圖和字符串圖的不同算法來(lái)組裝序列[26]。二代測(cè)序的短讀長(zhǎng)采用DBG進(jìn)行組裝，而SMRT和ONT采用適用于長(zhǎng)讀長(zhǎng)組裝的OLC方法。MinION和SMRT產(chǎn)生的讀長(zhǎng)用Falcon、Miniasm、Hybrid等組裝程序組裝發(fā)現(xiàn),SMRT讀長(zhǎng)組裝的錯(cuò)配數(shù)更少，精確度明顯高于MinION，但組裝程序?qū)畚?TTTTT、AAAAA、CCCCC和GGGGG)識(shí)別較差[4]。使用Illumina短讀長(zhǎng)和ONT長(zhǎng)讀長(zhǎng)的聯(lián)合組裝(Unicycler)可充分利用二者優(yōu)勢(shì)，拼接富含質(zhì)粒的細(xì)菌基因組，組裝更大的重疊群[27]。Unicycler對(duì)WGS后質(zhì)粒的組裝包括7步：1)使用高準(zhǔn)確度的Illumina短讀長(zhǎng)進(jìn)行組裝，設(shè)置k-mer值構(gòu)建重疊群[28]，去除深度<50%DBG的重疊群，消除大多數(shù)污染序列；2)貪婪法使用測(cè)序深度和連接信息確定重疊群的多重性，將多重性分配給染色體重疊群之外的高拷貝數(shù)質(zhì)粒重疊群；3)通過(guò)構(gòu)建短讀長(zhǎng)的搭橋連接成對(duì)的單拷貝重疊群，配對(duì)末端，短讀長(zhǎng)可解析小重復(fù)序列；4)長(zhǎng)讀長(zhǎng)的搭橋,與多個(gè)單拷貝重疊群比對(duì)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)可用于橋接，長(zhǎng)讀長(zhǎng)可解析更大的重復(fù)序列，橋接序列來(lái)自2個(gè)連續(xù)序列之間的圖，而不是長(zhǎng)讀長(zhǎng)，可提高序列的準(zhǔn)確性，當(dāng)存在多個(gè)橋接路徑時(shí)，根據(jù)與長(zhǎng)讀長(zhǎng)一致序列選擇最佳搭橋路徑；5)橋的應(yīng)用，Unicycler為每一個(gè)橋分配了質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并按質(zhì)量遞減順序應(yīng)用橋，確保當(dāng)存在多個(gè)矛盾的橋時(shí)，使用最佳匹配的選項(xiàng)；6)刪除已在橋中使用且不提供額外連接信息的重疊群，將橋合并形成大的重疊群，再使用TBLASTN搜索dnaA或repA等位基因[29]，使其開始于正鏈上編碼的基因，降低基因在序列開始和結(jié)束處斷開的風(fēng)險(xiǎn)；7)使用短讀長(zhǎng)對(duì)重疊群進(jìn)行校正，降低不匹配率[30]。使用Unicycler組裝得到的質(zhì)粒，準(zhǔn)確度由Illumina短讀長(zhǎng)的準(zhǔn)確度決定，可有效避免ONT長(zhǎng)讀長(zhǎng)拆分錯(cuò)誤引入的序列污染，最后利用二代短讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)對(duì)組裝質(zhì)粒進(jìn)行糾錯(cuò)，得到準(zhǔn)確度高的基因組。

3 WGS后質(zhì)粒的鑒定

WGS獲得大量片段化的質(zhì)粒讀長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)其組裝和解讀，進(jìn)一步分析質(zhì)粒序列特征，了解菌株的生物學(xué)特性。隨著WGS技術(shù)的發(fā)展，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中產(chǎn)生許多測(cè)序后組裝的質(zhì)粒，然而組裝質(zhì)粒并沒(méi)有得到鑒定和分析，分析質(zhì)粒序列仍具有挑戰(zhàn)性。鑒定質(zhì)粒的方法可分為2種[31]：1)從測(cè)序讀長(zhǎng)或組裝圖中重建整個(gè)質(zhì)粒序列，如Recycler、PlasmidSPAdes、PLANCET[32-34]；2)通過(guò)鑒定或驗(yàn)證組裝的重疊群是否來(lái)自質(zhì)?！，F(xiàn)有鑒定重疊群是否來(lái)自質(zhì)粒的預(yù)測(cè)程序可分為3種[35]：1)通過(guò)標(biāo)記基因搜索的方法，如搜索序列中復(fù)制子的PlasmidFinder[36]；2)基于質(zhì)粒和染色體序列的基因組特征的方法，如根據(jù)質(zhì)粒序列和染色體序列的k-mer頻率的cBar、Plasmidseeker、Mlplasmids、PlasFlow[37-40]；3)基于讀長(zhǎng)深度和GC%含量特征鑒定質(zhì)粒[41]。

Carattoli等[36]利用PlasmidFinder對(duì)559個(gè)質(zhì)粒序列進(jìn)行鑒定，成功識(shí)別263個(gè)質(zhì)粒。PlasmidFinder是依據(jù)參考復(fù)制子來(lái)鑒定質(zhì)粒序列，因此無(wú)法鑒定與參考質(zhì)粒序列無(wú)明顯相似性的新型質(zhì)粒[33]。Zhou等[37]根據(jù)五聚體頻率的差異,使用cBar程序從881個(gè)完全測(cè)序的原核生物基因組中區(qū)分染色體序列和質(zhì)粒序列，分類準(zhǔn)確度為92%。Roosaare等[38]用Plasmidseeker對(duì)8 514個(gè)質(zhì)粒序列進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其靈敏度達(dá)100.00%，特異性為99.98%，但無(wú)法檢測(cè)拷貝數(shù)低且與參考質(zhì)粒相似性低的質(zhì)粒。研究[42]顯示,質(zhì)粒檢測(cè)的敏感性cBar最高(87.45%)，其次是PlasmidSPAdes(81.49%)和PlasmidFinder(36.47%)。但另一項(xiàng)研究[40]表明，cBar錯(cuò)誤預(yù)測(cè)其他序列為質(zhì)粒序列(假陽(yáng)性)的錯(cuò)誤率達(dá)6.46%。在一項(xiàng)148個(gè)參考質(zhì)粒的鑒定案例中，PlasmidSPAdes正確預(yù)測(cè)了125個(gè)質(zhì)粒，cBar正確預(yù)測(cè)了84個(gè)質(zhì)粒，Recycler正確預(yù)測(cè)了21個(gè)質(zhì)粒，PlasmidFinder正確預(yù)測(cè)了13個(gè)質(zhì)粒[31]。綜上，質(zhì)粒的組裝或鑒定工具的檢測(cè)能力有明顯差異，無(wú)法正確檢測(cè)質(zhì)粒，WGS裝配工具的精度有待進(jìn)一步提高。

4 WGS后質(zhì)粒組裝存在的問(wèn)題

在一項(xiàng)對(duì)植物乳桿菌PC518菌株進(jìn)行WGS發(fā)現(xiàn)，通過(guò)全質(zhì)粒組測(cè)序和PCR擴(kuò)增全序列的方法鑒定了WGS后的組裝質(zhì)粒[43]。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，大質(zhì)粒只能被擴(kuò)增出一段序列，并非真實(shí)存在的質(zhì)粒(假陽(yáng)性質(zhì)粒)，表明大質(zhì)粒序列中可能出現(xiàn)染色體序列或其他質(zhì)粒序列的錯(cuò)誤識(shí)別并被組裝到1個(gè)質(zhì)粒上。WGS和全質(zhì)粒組測(cè)序的2次測(cè)序均組裝出序列一致的大質(zhì)粒，表明染色體序列和質(zhì)粒序列仍難正確區(qū)分[42]。在WGS和全質(zhì)粒組測(cè)序中有部分堿基不同的組裝質(zhì)粒，表明WGS中存在錯(cuò)誤測(cè)序的堿基。在全質(zhì)粒組測(cè)序中出現(xiàn)1個(gè)WGS中未發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗(yàn)證是1個(gè)完整的質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),該質(zhì)粒被錯(cuò)誤組裝在WGS的大質(zhì)粒上，WGS中出現(xiàn)假陰性質(zhì)粒。WGS未能正確組裝出質(zhì)粒的重復(fù)序列，當(dāng)基因組序列中有高度重復(fù)序列區(qū)、插入序列、極端GC%含量或不同的甲基化模型時(shí)，短讀長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生不正確的組裝[44-45]。

從WGS數(shù)據(jù)中鑒定質(zhì)?；蛉旧w的序列是一大挑戰(zhàn)，然而質(zhì)粒重疊群的合并比其鑒別更困難[41]，短讀長(zhǎng)測(cè)序無(wú)法解析重復(fù)元件，導(dǎo)致每個(gè)基因組產(chǎn)生數(shù)百個(gè)重疊群[34]。有研究[18]描述WGS后基因組組裝中遇到的問(wèn)題：利用短讀長(zhǎng)組裝無(wú)法解決rRNA的長(zhǎng)串聯(lián)拷貝、其他串聯(lián)重復(fù)序列和高GC%含量的區(qū)域(90%～100%)引起的問(wèn)題。質(zhì)粒組裝過(guò)程中存在多種重復(fù)：質(zhì)粒內(nèi)重復(fù)是指質(zhì)粒內(nèi)的重復(fù)；質(zhì)粒間重復(fù)是指由多個(gè)質(zhì)粒共享的重復(fù)；共享重復(fù)是指在質(zhì)粒和染色體之間共享的重復(fù)[46]。這些重復(fù)序列可以是2個(gè)或數(shù)百萬(wàn)個(gè)拷貝，用短讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)難以解決。短讀長(zhǎng)測(cè)序產(chǎn)生數(shù)百個(gè)染色體和質(zhì)粒重疊群組成的片段組合，短讀長(zhǎng)從頭組裝，導(dǎo)致片段化組裝和錯(cuò)誤組裝[39]。Arredondo-Alonso等[31]研究表明，長(zhǎng)片段測(cè)序可幫助染色體和染色體外序列的解析。長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序雖可改善基因組組裝的連續(xù)性問(wèn)題，提高重復(fù)序列的裝配質(zhì)量，但仍有較多的插入或缺失難以檢測(cè)和糾正[42]。

隨著Illumina測(cè)序技術(shù)不斷增長(zhǎng)，在同一流動(dòng)池中，對(duì)多個(gè)樣本同時(shí)測(cè)序變得越來(lái)越普遍。每個(gè)樣本使用索引，然后在相同的流動(dòng)池中一起測(cè)序，因存在一些混合的可能性，其中基因組DNA讀取被分配到錯(cuò)誤的索引，從而被分配到錯(cuò)誤的樣本中[47]。這些污染序列來(lái)自其他DNA樣本的交叉污染，或是用于測(cè)序的DNA樣本中的細(xì)菌污染，或是測(cè)序中特意引入用于質(zhì)量控制的噬菌體DNA。污染序列影響下游數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量，導(dǎo)致序列錯(cuò)誤組裝，去除污染序列是所有測(cè)序項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制。利用BLAST與參考基因比對(duì)，排除污染序列，其速度慢且參考基因的空白或基因組中結(jié)構(gòu)變異均可出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[48]。當(dāng)一個(gè)樣本被不同基因型的DNA污染時(shí)，得到不同單核苷酸多態(tài)性等位基因比率，然后通過(guò)篩選對(duì)污染序列進(jìn)行識(shí)別和定量[49]。污染序列隨著測(cè)序深度增加而減少，因此提高測(cè)序深度可降低污染序列的影響[50]。

由于一些質(zhì)粒不包含任何明顯的質(zhì)?；?，質(zhì)粒逃避檢測(cè)或因質(zhì)粒拷貝數(shù)與染色體相似，可預(yù)測(cè)出假陰性質(zhì)粒。一些錯(cuò)誤分類的染色體重疊群作為質(zhì)粒來(lái)源，或非質(zhì)粒的環(huán)鏈被報(bào)告為質(zhì)粒[42,46]。因受到染色體序列的污染，質(zhì)粒預(yù)測(cè)通常是不完整的，在預(yù)測(cè)的質(zhì)粒中經(jīng)常存在染色體衍生的重疊群[39]。因重復(fù)序列的存在，在區(qū)分染色體序列和質(zhì)粒序列方面仍存在一定問(wèn)題[42]。質(zhì)粒常攜帶重復(fù)元件，組裝質(zhì)粒與其他質(zhì)粒和微生物基因組有共享基因[32]，細(xì)菌基因組中頻繁出現(xiàn)的插入序列和轉(zhuǎn)座元件阻止了質(zhì)粒的完整組裝。

5 展望

WGS后質(zhì)粒的組裝和鑒定是一項(xiàng)艱巨的任務(wù),SMRT和ONT具有很大的發(fā)展?jié)摿?，然而堿基的高錯(cuò)誤率對(duì)正確組裝質(zhì)粒序列提出挑戰(zhàn)。組裝質(zhì)粒獲得有利于質(zhì)粒工具的發(fā)展，但這些組裝質(zhì)粒存在錯(cuò)誤組裝、假陽(yáng)性質(zhì)粒、假陰性質(zhì)粒的問(wèn)題。WGS后質(zhì)粒組裝的精度需要專業(yè)技術(shù)人員參與，更新組裝軟件，改良WGS后的質(zhì)粒組裝。