• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    木質(zhì)素中酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇發(fā)酵的影響

    2013-11-06 08:52:44張連華陳洪章
    生物質(zhì)化學(xué)工程 2013年4期
    關(guān)鍵詞:丁醇梭菌酚酸

    張連華,王 嵐,陳洪章*

    (1.中國科學(xué)院過程工程研究所,生物工程國家重點實驗室,北京 100190;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

    化石能源日益短缺,生物質(zhì)能源是一種很有前景的替代能源[1-2]。生物質(zhì)通過生物轉(zhuǎn)化生成的生物燃料中,丁醇被認(rèn)為是具有廣泛應(yīng)用前景的新一代生物燃料[3]。丙酮丁醇梭菌具有同時利用木質(zhì)纖維素酶解產(chǎn)生五、六碳糖及寡糖的優(yōu)勢[4-5]。丙酮丁醇發(fā)酵(簡稱丁醇發(fā)酵)成為工業(yè)界與學(xué)術(shù)界共同關(guān)注的熱點問題。木質(zhì)纖維素在預(yù)處理過程中會產(chǎn)生一定量的副產(chǎn)物,其中包括酚酸、糠醛、稀酸等[6],這些副產(chǎn)物具有一定的毒性,嚴(yán)重降低了發(fā)酵效率,甚至可以完全抑制發(fā)酵的進(jìn)行,其中毒性最大的為酚類化合物,主要來源于木質(zhì)素的降解[7],它們能滲透到細(xì)胞膜內(nèi),破壞細(xì)胞的完整性和活性,影響發(fā)酵的正常進(jìn)行[8]。為了正常發(fā)酵,首先要進(jìn)行脫毒處理或選育抗性發(fā)酵菌株,使丙酮丁醇發(fā)酵成本增加[9-10],因此以對丙酮丁醇梭菌抑制最大的酚酸物質(zhì)作為考察對象,系統(tǒng)研究其對丙酮丁醇梭菌生長代謝的影響,以期在此基礎(chǔ)上建立不需要脫毒處理的發(fā)酵工藝,同時研究酚酸毒性與其物性的關(guān)系,為預(yù)測其他酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌毒性大小建立理論依據(jù)。

    木質(zhì)素降解產(chǎn)生的酚酸類物質(zhì)分為3種結(jié)構(gòu)類型:愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)(G型)、紫丁香基結(jié)構(gòu)(S型)和對羥苯基結(jié)構(gòu)(H型)。為了研究木質(zhì)素中酚酸類物質(zhì)對于丙酮丁醇發(fā)酵影響的普遍規(guī)律,作者選取了3種類型中具有代表性的4種酚酸物質(zhì)作為研究對象:阿魏酸(G型)、香草酸(G型)、丁香酸(S型)和對羥基苯甲酸(H型)[11]。丁醇是丙酮丁醇發(fā)酵中最主要的產(chǎn)品,因此本文只考察了丁醇產(chǎn)量的變化。

    1 實驗

    1.1 菌種及發(fā)酵方法

    丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC824,購自中科院微生物菌種保藏中心。保存培養(yǎng)基為:5% 玉米粉,置于4℃ 冰箱保存。發(fā)酵培養(yǎng)基為:60 g/L葡萄糖,3.68 g/L硫酸銨,1.768 g/L磷酸二氫鉀,2.938 g/L磷酸氫二鉀,10 mg/L對氨基苯甲酸,10 mg/L生物素,0.2% 氫氧化鈣,無機(jī)鹽營養(yǎng)液1 mL(1 L 無機(jī)鹽溶液含:NaMoO4·2H2O,2.4 g;CoCl2·6H2O,0.24 g;CaCl2·2H2O,1.5 g;FeCl3·6H2O,27 g;H2SO4,28 mL;CuSO4·5H2O,0.25 g;ZnSO4·7H2O,0.29 g;MnSO4·H2O,1.7 g;MgSO4,12 g),pH值為6.5~7.0。所有試劑都為分析純,購自北京化學(xué)試劑公司。

    1.2 添加酚酸物質(zhì)丙酮丁醇發(fā)酵實驗方法

    將阿魏酸、香草酸、丁香酸、對羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品按照 0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 g/L 濃度加入葡萄糖培養(yǎng)基,按照10%接種量接入活化24 h后的菌種,37℃ 在厭氧培養(yǎng)箱(YQX-II上海新苗醫(yī)療器械制造公司)中靜置培養(yǎng)。測定48 h和120 h時丁醇產(chǎn)量及生物量。

    1.3 汽爆玉米秸稈酶解液不脫毒直接丁醇發(fā)酵實驗過程

    汽爆玉米秸稈酶解液中含有總酚酸1.21 g/L(采用紫外可見分光光度法,按照王琳等方法進(jìn)行[12]),補(bǔ)糖至總糖60 g/L,按照1.1節(jié)中方法將其他營養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)全。分別按照體積分?jǐn)?shù)10%、20%、30%、50%接種量接入活化24 h的菌種,37℃ 在厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)120 h后測定全部實驗組丁醇產(chǎn)量。

    1.4 丁醇產(chǎn)量及生物量檢測方法

    丁醇產(chǎn)量采用安捷倫GC-7890A型號氣相色譜進(jìn)行測定,毛細(xì)管柱為Innowax 19091N-113,30 m×0.32 mm×0.25 mm,氫火焰檢測器,載氣為氮氣,氮氣和氫氣的流速比為10∶1,氮氣、氫氣和空氣3種氣體總壓力為1.2 kg/cm2。測定條件:進(jìn)樣器和檢測器溫度均為250℃,柱箱初始溫度為85℃,維持4.5 min后,以20℃/min的速度升至170℃ 并保持2.5 min,以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物。生物量采用比色法,按照Wang等[13]的方法使用紫外分光光度計(UVmini-1240日本島津)進(jìn)行測定。

    1.5 物性計算方法

    IC50定義為丁醇產(chǎn)量為對照組一半時所對應(yīng)的酚酸含量,通過劃線法得到[14],logP、pKa由Chemoffice軟件計算得到,相關(guān)系數(shù)由軟件SPSS17計算得到。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 4種酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌生長與代謝的影響

    4種酚酸物質(zhì)對丁醇產(chǎn)量和生物量的影響如圖1~圖2所示。從圖1(a)中可以看出,48 h時實驗組丁醇產(chǎn)量均低于對照組(酚酸添加量為0的組),但從圖1(b)中可以看出,120 h時隨著酚酸濃度的增加,4個實驗組丁醇產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,其中阿魏酸組丁醇產(chǎn)量最高點為100 mg/L濃度時,為15.43 g/L,比對照13.51 g/L高出14.21%,而大于100 mg/L開始丁醇產(chǎn)量迅速下降,1 000 mg/L時,丁醇產(chǎn)量為1.15 g/L,抑制率達(dá)到91.49%;香草酸組最高點為100 mg/L濃度,為14.30 g/L,比對照13.51 g/L高出5.85%,而大于100 mg/L丁醇產(chǎn)量迅速下降,1 000 mg/L時,丁醇產(chǎn)量為0.45 g/L,抑制率達(dá)到 96.67%。丁香酸組最高點為 100 mg/L濃度,為 14.63 g/L,比對照 13.51 g/L高出8.29%,而大于100 mg/L丁醇產(chǎn)量迅速下降,1 000 mg/L時,丁醇產(chǎn)量為 1.01 g/L,抑制率達(dá)到92.52%。對羥基苯甲酸組與其他3組都不同的是最高點為50 mg/L濃度為16.39 g/L,比對照13.51 g/L高出21.32%,且100 mg/L也要比對照高。而大于100 mg/L丁醇產(chǎn)量迅速下降,1 000 mg/L時,丁醇產(chǎn)量為0.45 g/L,抑制率達(dá)到96.08%。

    從圖2(a)中可以看出在48 h時,實驗組生物量低于對照組,這說明丙酮丁醇梭菌生長前期被酚酸物質(zhì)抑制,但是酚酸物質(zhì)量少時,抑制較弱。從圖2(b)中可以看出,120 h時實驗組生物量與丁醇產(chǎn)量趨勢一致,呈現(xiàn)先增后減趨勢,低劑量的酚酸物質(zhì)不僅促進(jìn)了丁醇的產(chǎn)量,也促進(jìn)了丙酮丁醇梭菌的繁殖,100 mg/L香草酸組其生物量是對照組的4.50倍。但是酚酸物質(zhì)濃度增大到一定程度,對菌體生長也將產(chǎn)生抑制效果,4個實驗組在1 000 mg/L時,生物量都為0,生長被完全抑制。

    從上述結(jié)果可以看出,低劑量的酚酸物質(zhì)對于丁醇產(chǎn)量和丙酮丁醇梭菌生物量起到促進(jìn)作用,加入50 mg/L對羥基苯甲酸的實驗組促進(jìn)作用最明顯,丁醇產(chǎn)量比對照組(酚酸添加量為0)高21.32%,但是隨著抑制物濃度再次增加時,會呈現(xiàn)明顯的抑制作用,如香草酸濃度為1 000 mg/L時,抑制率達(dá)到96.67%。這是一種低劑量促進(jìn)效應(yīng)[15],高劑量的毒性物質(zhì)起到抑制作用,而低劑量時會起到一定的促進(jìn)作用,該效應(yīng)主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及環(huán)保毒理評價中[16],未見有國內(nèi)外文獻(xiàn)報道其在發(fā)酵抑制物方面的應(yīng)用。酚酸物質(zhì)在丁醇發(fā)酵中呈現(xiàn)低劑量興奮效應(yīng),推測其原因為:從菌株個體角度看,加入少量酚酸物質(zhì)時,活力較差的菌株會因為酚酸物質(zhì)的毒性被淘汰掉,剩下的高活力菌株則能得到更多的營養(yǎng)進(jìn)行繁殖和代謝,但此時整體來看還是部分被抑制,所以48 h實驗組的生物量會低于對照組;接下來高活力菌體大量繁殖后,單個細(xì)菌所承受的抑制壓力減少,抑制得以解除,而此時的菌體高活性菌株占主體,所以從整體來看,丙酮丁醇梭菌的總體的活性便增強(qiáng)了,即呈現(xiàn)出促進(jìn)作用;若酚酸濃度過低,其篩選高活力菌株的作用不明顯,其促進(jìn)作用就較弱,所以除去對羥基苯甲酸實驗組的其它3組中,50 mg/L組的丁醇產(chǎn)量均比100 mg/L組低;而酚酸濃度過高時,高活力的菌株也會被嚴(yán)重抑制,所以整體菌株的生長和代謝都受到嚴(yán)重影響,濃度足夠高時,則完全停止生長[17-18],所以酚酸濃度大于100 mg/L并逐漸增加時,丁醇產(chǎn)量和丙酮丁醇梭菌生物量逐漸減少,直至降至0。據(jù)此分析,可以通過增加菌體量降低抑制物濃度,來解除抑制,將酚酸濃度控制到合適濃度時,甚至可以起到促進(jìn)作用。

    2.2 汽爆玉米秸稈酶解液不脫毒直接丁醇發(fā)酵工藝

    圖3 不同接種量對不脫毒直接丁醇發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different inoculation rates on butanol yield in butanol fermentation

    從圖3中可以看出,隨著接種量(120 h時)從10% 增加至30%,丁醇產(chǎn)量逐漸增加,這是因為增大接種量時,發(fā)酵液被一定程度稀釋,而且由于接入的菌體量大,平均每個菌體所受到的抑制降低,整體的抑制也逐漸降低,代謝增強(qiáng),所以丁醇產(chǎn)量逐漸增加,接種量30% 時,丁醇產(chǎn)量達(dá)到9.16 g/L,達(dá)到了一般文獻(xiàn)中報道的丁醇產(chǎn)量[19];而接種量為50% 時,其丁醇產(chǎn)量低于接種量30% 組,是因為此時稀釋濃度過大,酚酸的低劑量促進(jìn)作用不明顯,且培養(yǎng)基中的碳源一定,即產(chǎn)物總量一定,發(fā)酵液體積增加,必然丁醇濃度降低。

    此結(jié)果說明,通過增大接種量實現(xiàn)木質(zhì)纖維素水解液的不脫毒直接丁醇發(fā)酵是可行的,30%接種量是比較合適的條件。

    2.3 木質(zhì)素中酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌的毒性與其物性的關(guān)系

    不同的酚酸物質(zhì)其影響趨勢一致,但其低劑量效應(yīng)轉(zhuǎn)折點,即其對于丙酮丁醇梭菌的毒性不盡相同,為了考察不同酚酸對與丙酮丁醇梭菌毒性大小的影響因素,考察了IC50值與logP、pKa和分子量之間的相關(guān)性。

    IC50定義為丁醇產(chǎn)量為對照一半時的酚酸含量,IC50越小,其毒性越強(qiáng),即較低的濃度就可產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制。logP為正辛烷/水分配系數(shù),代表了這種物質(zhì)的疏水性大小,該數(shù)值越大,其疏水性越大。pKa為電離常數(shù)項,體現(xiàn)了分子的電子效應(yīng),pKa反映分子的釋質(zhì)子能力,pKa越大,釋質(zhì)子能力越弱,表明親核性越強(qiáng)。相反,pKa越小,釋質(zhì)子能力越大,表明親電性越強(qiáng)。

    由表1可知,IC50與logP相關(guān)性為-0.286,不顯著負(fù)相關(guān);IC50與pKa相關(guān)性為0.816,顯著正相關(guān);與分子質(zhì)量相關(guān)系數(shù)為0.876,顯著正相關(guān)。由以上數(shù)據(jù)可以看出酚酸物質(zhì)其毒性與電離常數(shù)和分子質(zhì)量相關(guān)性非常大,都大于0.8,電離常數(shù)越小,分子質(zhì)量越小,IC50越小,即毒性越大,分析原因可能是分子質(zhì)量越小越容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),且親核性強(qiáng),不易被胞內(nèi)物質(zhì)反應(yīng)掉,毒性持久。與疏水性呈現(xiàn)不顯著的負(fù)相關(guān)。根據(jù)理論分析,logP越大,即疏水性越強(qiáng),其對于細(xì)菌細(xì)胞膜侵害性會越強(qiáng),IC50會越小,與上述負(fù)相關(guān)數(shù)據(jù)一致,但是相關(guān)系數(shù)較小,說明疏水性大小對于細(xì)菌的毒性影響相對較小,文獻(xiàn)中報道酚酸對于大型蚤的影響logP大于pKa的影響[20],本研究結(jié)果正好相反,分析是因為丙酮丁醇梭菌與大型跳蚤的結(jié)構(gòu)不一樣。定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure activity relationships,QSAR)主要應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)及藥物設(shè)計[21-22],未見有文獻(xiàn)報道將其用于評價酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌毒性。

    表1 4種酚酸物性參數(shù)及其IC50值Table 1 Material parameters and their IC50 values of four kinds of phenolic acids

    3 結(jié)論

    3.1 木質(zhì)素中酚酸物質(zhì)在低濃度下對丙酮丁醇梭菌生長與代謝具有促進(jìn)作用,酚酸濃度達(dá)到一定時才有抑制作用;建立了通過加大接種量增強(qiáng)菌體抑制點不必脫毒直接進(jìn)行發(fā)酵的新工藝。

    3.2 作者將定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)應(yīng)用到評價酚酸物質(zhì)對于丙酮丁醇梭菌毒性大小,為判斷不同物質(zhì)對于丁醇發(fā)酵毒性大小提供了理論依據(jù)。

    [1]蔣劍春.生物質(zhì)能源應(yīng)用研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2002,32(2):75-80.

    [2]袁振宏,呂鵬梅,孔曉英.生物質(zhì)能源開發(fā)與應(yīng)用現(xiàn)狀和前景[J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2006,40(增刊):13-21.

    [3]DURRE P.Biobutanol:An attractive biofuel[J].Biotechnology Journal,2007,2(12):1525-1534.

    [4]高凱,李云,楊秀山.影響丙酮丁醇發(fā)酵的主要因素及解決方案的研究進(jìn)展[J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2011,45(2):45-50.

    [5]陳洪章,王嵐.生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化技術(shù)與應(yīng)用 (Ⅷ)——生物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)原理與應(yīng)用[J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2008,42(4):67-72.

    [6]陳洪章,劉麗英.蒸汽爆碎技術(shù)原理及應(yīng)用[M]:北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007.

    [7]LARSSON S,PALMQVIST E,HAHN-HAGERDAL B.The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood[J].Enzyme and Microbial Technology,1999,24(3):151-159.

    [8]PALMQVIST E,HAHN-HAGERDAL B.Fermentation of lignocellulosic hydrolysates(II):Inhibitors and mechanisms of inhibition[J].Bioresource Technology,2000,74(1):25-33.

    [9]莊軍平,林鹿,龐春生,等.木質(zhì)纖維素稀水解液脫毒研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工,2009(2):19-23.

    [10]曾凡洲,蔣劍春,衛(wèi)民,等.生物質(zhì)水解發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展[J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2009,43(2):43-48.

    [11]蔣挺大.木質(zhì)素[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001.

    [12]王琳,郜昭慧,程忠哲,等.紫外可見分光光度法測定馬齒莧中總酚酸的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012(5):223-225.

    [13]WANG L,CHEN H Z.Increased fermentability of enzymatically hydrolyzed steam-exploded corn stover for butanol production by removal of fermentation inhibitors[J].Process Biochemistry,2011,46(2):604-607.

    [14]趙斌,葛金芳,朱娟娟.小議在 MTT法測細(xì)胞增殖抑制率中IC50的計算方法[J].安徽醫(yī)藥,2007,11(9):834-836.

    [15]CALABRESE E,BALDWIN L.Defining hormesis[J].Human and Experimental Toxicology,2002,21(2):91-97.

    [16]讓歐艷,讓蔚清.低劑量興奮效應(yīng)及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué),2009,16(1):300-303.

    [17]申開麗,俞潔,林廣,等.低劑量刺激效應(yīng)在污染物風(fēng)險評價中的意義及前景[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2012,29(3):183-186.

    [18]陶功華.低劑量興奮效應(yīng)作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊:自然科學(xué),醫(yī)學(xué)版,2007(1):16-21.

    [19]郭亭,孫佰軍,梁達(dá)奉,等.不同C源對丙酮丁醇梭菌產(chǎn)丁醇的影響[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,33(2):20-23.

    [20]于瑞蓮,趙元慧.酚類對大型蚤的急性毒性及QSAR研究[J].華僑大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003,24(1):44-47.

    [21]柳波,謝惠定,李玉鵬,等.Novobiocin類化合物抑制胰腺癌細(xì)胞的2D-QSAR研究[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012(11):8-12.

    [22]顧云蘭.酚類化合物對蝌蚪急性毒性的定量構(gòu)效關(guān)系研究[J].科技通報,2012,28(1):25-29.

    猜你喜歡
    丁醇梭菌酚酸
    丁酸梭菌的篩選、鑒定及生物學(xué)功能分析
    中國飼料(2021年17期)2021-11-02 08:15:10
    雙咖酚酸在小鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)與組織分布
    丹參中丹酚酸A轉(zhuǎn)化方法
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:19:04
    川芎總酚酸提取工藝的優(yōu)化
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:02
    豬肉毒梭菌中毒癥的發(fā)生和診療方法
    西藏牦牛肉毒梭菌中毒病的防治
    西藏科技(2015年10期)2015-09-26 12:10:24
    結(jié)核分枝桿菌耐乙胺丁醇分子機(jī)制的研究進(jìn)展
    低溫濃醪發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇新工藝研究
    河南科技(2014年12期)2014-02-27 14:10:24
    一株真菌所產(chǎn)環(huán)縮酚酸肽類化合物的分離和鑒定
    纖維素發(fā)酵制丁醇獲專利
    亚洲内射少妇av| 国产激情久久老熟女| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 免费观看无遮挡的男女| 久久热在线av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 两个人看的免费小视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久狼人影院| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久久久久久国产电影| 亚洲久久久国产精品| 1024视频免费在线观看| 97在线视频观看| 精品一区二区三区视频在线| 日本欧美视频一区| 国产av精品麻豆| 国产极品粉嫩免费观看在线| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久人人人人人| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一级片'在线观看视频| 亚洲综合精品二区| av在线老鸭窝| 在线看a的网站| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| a级毛片黄视频| 夜夜爽夜夜爽视频| av网站免费在线观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩电影二区| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩av免费高清视频| 五月天丁香电影| 日本91视频免费播放| 欧美日韩综合久久久久久| 日本wwww免费看| 美女福利国产在线| 男女午夜视频在线观看 | 日韩三级伦理在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件 | 精品一区在线观看国产| 欧美3d第一页| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 欧美精品国产亚洲| 少妇熟女欧美另类| 久久久久精品人妻al黑| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线观看人妻少妇| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲国产av影院在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 久久久久久人人人人人| 国产av码专区亚洲av| 日日撸夜夜添| 久久久久精品性色| 熟女av电影| 大香蕉久久成人网| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲成人av在线免费| 国产成人91sexporn| 99久久综合免费| 老熟女久久久| 永久免费av网站大全| 国产精品三级大全| 香蕉精品网在线| 久久鲁丝午夜福利片| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜福利影视在线免费观看| 国产av一区二区精品久久| 一级,二级,三级黄色视频| 国产亚洲最大av| 欧美日韩av久久| 日韩电影二区| 欧美日韩视频精品一区| 国产免费一区二区三区四区乱码| av在线app专区| 国产av码专区亚洲av| 亚洲精品色激情综合| 老司机影院成人| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 久久国内精品自在自线图片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产一区二区在线观看日韩| 久久国内精品自在自线图片| 赤兔流量卡办理| 2022亚洲国产成人精品| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲第一av免费看| 超色免费av| 青青草视频在线视频观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩av免费高清视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| a级片在线免费高清观看视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久久久久国产电影| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品第一国产精品| 亚洲伊人色综图| 老司机影院毛片| 各种免费的搞黄视频| 下体分泌物呈黄色| 国产欧美亚洲国产| 在线观看三级黄色| 超碰97精品在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 成年女人在线观看亚洲视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 91精品国产国语对白视频| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 十八禁高潮呻吟视频| 天堂中文最新版在线下载| 精品久久国产蜜桃| 午夜精品国产一区二区电影| 男女免费视频国产| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品456在线播放app| 久久精品人人爽人人爽视色| 成人国语在线视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费看光身美女| 一区二区av电影网| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产又色又爽无遮挡免| 日本wwww免费看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲综合色惰| 韩国av在线不卡| 黄色一级大片看看| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品一区在线观看国产| 精品人妻一区二区三区麻豆| 超色免费av| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男人操女人黄网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品人妻久久久久久| 99香蕉大伊视频| 午夜老司机福利剧场| 午夜福利乱码中文字幕| 少妇人妻 视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 秋霞在线观看毛片| 九九在线视频观看精品| 免费大片18禁| 青春草视频在线免费观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 99久久精品国产国产毛片| 国产av一区二区精品久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 一本久久精品| 亚洲精品美女久久av网站| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品人妻久久久久久| 久久精品国产自在天天线| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久久欧美国产精品| 人人妻人人澡人人看| www日本在线高清视频| a级片在线免费高清观看视频| 少妇人妻 视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 伦精品一区二区三区| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美3d第一页| 久久久久久久久久久久大奶| 国产在视频线精品| 亚洲久久久国产精品| 99热网站在线观看| 久久99热6这里只有精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 9色porny在线观看| 男女午夜视频在线观看 | 自线自在国产av| 母亲3免费完整高清在线观看 | 精品一区二区三区视频在线| 久久国产精品大桥未久av| 多毛熟女@视频| 晚上一个人看的免费电影| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产av国产精品国产| 国产成人精品一,二区| 日本与韩国留学比较| 咕卡用的链子| 不卡视频在线观看欧美| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 婷婷成人精品国产| 男女边摸边吃奶| 国产精品久久久久久av不卡| 久久亚洲国产成人精品v| 精品一区二区免费观看| 999精品在线视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产免费福利视频在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 十八禁网站网址无遮挡| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 蜜桃国产av成人99| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 丝袜美足系列| 18禁国产床啪视频网站| 国产男女内射视频| 国产69精品久久久久777片| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲伊人久久精品综合| 黄色毛片三级朝国网站| 最近2019中文字幕mv第一页| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 18禁动态无遮挡网站| 亚洲在久久综合| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 多毛熟女@视频| 国内精品宾馆在线| 亚洲图色成人| 精品国产露脸久久av麻豆| 丰满乱子伦码专区| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 丰满少妇做爰视频| 少妇高潮的动态图| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产色婷婷99| 亚洲av男天堂| 高清毛片免费看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 下体分泌物呈黄色| 成年美女黄网站色视频大全免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精品一二三| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲五月色婷婷综合| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲高清免费不卡视频| 在线天堂中文资源库| 黑人猛操日本美女一级片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 人人妻人人澡人人看| 国产乱来视频区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 一区二区三区四区激情视频| 99re6热这里在线精品视频| 大片电影免费在线观看免费| 精品亚洲成国产av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 韩国高清视频一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 国产精品久久久久成人av| 五月开心婷婷网| 搡老乐熟女国产| 天天影视国产精品| 一本色道久久久久久精品综合| 久热久热在线精品观看| 1024视频免费在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 捣出白浆h1v1| 黄片播放在线免费| kizo精华| 国产视频首页在线观看| 久久婷婷青草| 亚洲内射少妇av| 久久久国产欧美日韩av| 最近最新中文字幕免费大全7| 午夜精品国产一区二区电影| 观看av在线不卡| 亚洲精品第二区| 国产免费一级a男人的天堂| 久久午夜福利片| 不卡视频在线观看欧美| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 黄色配什么色好看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 老女人水多毛片| 日本午夜av视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 全区人妻精品视频| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品国产av在线观看| 精品国产一区二区久久| 妹子高潮喷水视频| 亚洲精品自拍成人| 国产片特级美女逼逼视频| 90打野战视频偷拍视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩成人伦理影院| 欧美另类一区| 国产高清三级在线| 国产一区二区在线观看av| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲av电影在线进入| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲,欧美,日韩| 午夜激情久久久久久久| 国产xxxxx性猛交| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩一区二区三区影片| 成人毛片60女人毛片免费| 大片免费播放器 马上看| 蜜桃在线观看..| 成人国语在线视频| 乱人伦中国视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 秋霞伦理黄片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 97精品久久久久久久久久精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 韩国精品一区二区三区 | 国产成人aa在线观看| 香蕉丝袜av| av国产精品久久久久影院| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国精品久久久久久国模美| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 日本91视频免费播放| 26uuu在线亚洲综合色| 久久99热6这里只有精品| 母亲3免费完整高清在线观看 | 中国国产av一级| 久热这里只有精品99| 亚洲综合色惰| 国产乱人偷精品视频| 观看av在线不卡| 97精品久久久久久久久久精品| 熟女电影av网| 亚洲国产最新在线播放| 大陆偷拍与自拍| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 波野结衣二区三区在线| 一区二区三区乱码不卡18| 夫妻性生交免费视频一级片| 最近手机中文字幕大全| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一本大道久久a久久精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 一本大道久久a久久精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产老妇伦熟女老妇高清| 制服丝袜香蕉在线| 97人妻天天添夜夜摸| 国产精品 国内视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜激情av网站| 日韩av不卡免费在线播放| 97人妻天天添夜夜摸| a级毛片在线看网站| 狂野欧美激情性bbbbbb| av播播在线观看一区| 999精品在线视频| 69精品国产乱码久久久| 国产在线一区二区三区精| 日本vs欧美在线观看视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩欧美一区视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 尾随美女入室| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产一区二区激情短视频 | 伊人久久国产一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品视频人人做人人爽| 在线观看三级黄色| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日本黄大片高清| 久久久国产一区二区| 五月天丁香电影| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产免费福利视频在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产免费一区二区三区四区乱码| 免费观看在线日韩| 9热在线视频观看99| 日韩人妻精品一区2区三区| 秋霞在线观看毛片| 69精品国产乱码久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 一级片'在线观看视频| 久久这里有精品视频免费| 国产片内射在线| 人妻一区二区av| av国产精品久久久久影院| videosex国产| 99久国产av精品国产电影| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人aa在线观看| av在线观看视频网站免费| 免费看av在线观看网站| 成人国产麻豆网| 高清在线视频一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲av日韩在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 国产黄频视频在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲av.av天堂| 亚洲三级黄色毛片| 在线观看国产h片| 在线天堂中文资源库| 9191精品国产免费久久| 天天操日日干夜夜撸| 国产日韩欧美视频二区| 欧美bdsm另类| 欧美精品高潮呻吟av久久| 男女边吃奶边做爰视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 毛片一级片免费看久久久久| 高清黄色对白视频在线免费看| 在线免费观看不下载黄p国产| av播播在线观看一区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 少妇人妻久久综合中文| 欧美97在线视频| 搡老乐熟女国产| 91精品三级在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 国产成人精品福利久久| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲av.av天堂| 久久婷婷青草| xxxhd国产人妻xxx| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 18在线观看网站| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品人妻久久久影院| 考比视频在线观看| 免费观看性生交大片5| 99视频精品全部免费 在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 丝袜人妻中文字幕| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 色吧在线观看| 赤兔流量卡办理| 久久97久久精品| 在线天堂最新版资源| 我要看黄色一级片免费的| 在线天堂最新版资源| 美国免费a级毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品美女久久av网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 91精品三级在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| kizo精华| 久久ye,这里只有精品| 国产毛片在线视频| 制服人妻中文乱码| a级片在线免费高清观看视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 90打野战视频偷拍视频| 国产av国产精品国产| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲精品色激情综合| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产av一区二区精品久久| 久久青草综合色| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美成人午夜精品| 亚洲国产精品专区欧美| 午夜免费男女啪啪视频观看| 热re99久久国产66热| 边亲边吃奶的免费视频| 中文字幕亚洲精品专区| 少妇的逼好多水| 国产一区二区三区综合在线观看 | 大香蕉久久成人网| videos熟女内射| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久久久久久人人人人人人| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人国产麻豆网| 秋霞伦理黄片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美精品国产亚洲| 看免费成人av毛片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日本午夜av视频| 国产免费又黄又爽又色| 一级a做视频免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜福利乱码中文字幕| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品 国内视频| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品免费大片| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品一国产av| 天天影视国产精品| 一区二区三区四区激情视频| 中文天堂在线官网| 内地一区二区视频在线| 97在线视频观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 99热6这里只有精品| 国产成人91sexporn| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品久久久精品久久久| 国产精品成人在线| 国产又爽黄色视频| 高清不卡的av网站| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲图色成人| 青春草亚洲视频在线观看| 全区人妻精品视频| 婷婷成人精品国产| 高清av免费在线| 大香蕉久久网| 少妇 在线观看| 亚洲av.av天堂| 高清视频免费观看一区二区| av不卡在线播放| 日韩中字成人| 久久久精品免费免费高清| 久久午夜福利片| 国产精品偷伦视频观看了| 一级爰片在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 久久国产精品大桥未久av| 久久99热6这里只有精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 九草在线视频观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲av男天堂| 另类亚洲欧美激情| 国产在视频线精品| 观看av在线不卡| 成人午夜精彩视频在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 91aial.com中文字幕在线观看| 日韩视频在线欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲av国产av综合av卡| av在线老鸭窝| 高清不卡的av网站| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久97久久精品| 亚洲精品自拍成人| tube8黄色片| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日本91视频免费播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 男女边摸边吃奶| av在线老鸭窝| 国产1区2区3区精品| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品久久久av美女十八| 看免费av毛片| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲伊人色综图| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费观看av网站的网址| 中文字幕免费在线视频6| 欧美精品av麻豆av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品久久久久久精品古装| 午夜久久久在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产一级毛片在线| 丰满乱子伦码专区| 久久人妻熟女aⅴ| 久久久久久久国产电影| 国产日韩一区二区三区精品不卡| videosex国产| 老司机影院成人| 成人手机av| 成人漫画全彩无遮挡|