牛糞浸出液培養(yǎng)微藻系統優(yōu)化及含油率分析

丁愛軍，梁 穎，賈明良，2，覃佐東，2，張本厚，陳集雙，2*

(1.南京工業(yè)大學 大豐海洋產業(yè)研究院，江蘇 大豐 224100;2.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京210009)

隨著全球經濟的快速發(fā)展，能源的需求量日益增加且依存度不斷提高，導致地球上化石能源儲量日趨減少，為此尋找儲量豐富且環(huán)境友好的綠色生物質能源代替化石能源將成為解決能源危機及可持續(xù)發(fā)展的途徑之一［1］。近20年來，由動植物制備生物質柴油作為石油燃料的替代物，已引起世界各國的廣泛關注。目前利用生物質資源生產柴油技術已經成熟，如玉米、植物秸桿、微藻及地溝油等。國內外利用微藻如小球藻、螺旋藻、柵藻等進行能源開發(fā)有相關研究，其中以小球藻的研究最多，它的光合作用效率是一般高等植物的10倍左右。小球藻以自養(yǎng)、異養(yǎng)、混合養(yǎng)等方式生長，目前已知的有十幾種，包括變種在內，可達百種之多，具有分布廣泛，生長速度快，易于培養(yǎng)及富含脂肪等特點［2］。自20世紀50年代以來，研究人員開始用微藻進行水處理研究，發(fā)現其具有降解水體有毒污染物、富集重金屬離子等能力［3］。污水養(yǎng)藻是一種成本低廉、操作方便，易推廣及有利于生態(tài)健康的技術，同時還可凈化水體，是一種對環(huán)境減害化處理的同時獲得有用能源物質的較好方法。異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻可以克服自養(yǎng)培養(yǎng)的不足，是提高小球藻油脂含量的一條有效途徑。本實驗利用周邊奶牛養(yǎng)殖場糞便作為材料，研究其浸出物對球藻生長和脂肪結累等影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藻種 本實驗小球藻種于南京工業(yè)大學開放式小球藻培養(yǎng)池中獲取。

1.1.2 牛糞浸出培養(yǎng)基 牛糞取自上海光明集團大豐海豐奶牛場種植田邊堆場，經烘干除臭處理，按50 g/L加入蒸餾水中，攪拌20 min，稍加熱到80℃，400目過濾，靜置12 h，收集上清液備用。蒸餾水與牛糞浸出液體積比設定為:9∶1、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、1∶9，并用 1 mol/L HCl或 NaOH 調 pH 為 6.5 ～6.8，設陽性BG11及陰性蒸餾水為對照組，培養(yǎng)基經121℃高溫高壓滅菌處理20 min。

1.1.3 主要儀器 BOXUN醫(yī)用型超凈臺;L96G PCR儀、電泳系統及BioMate3S雙光束紫外光/可見光光譜儀;美國Syngene凝膠成像系統;光學顯微鏡;UB-7 pH計;SIGMA臺式高速冷凍離心機;XB-70制冰機及微量加樣器等。

1.1.4 主要試劑 配制 BG11培養(yǎng)基試劑為 KNO3、K2HPO4、Ca(NO3)2、MgSO4、KCl、FeCl3、H3BO4、Zn-SO4·7H2O、MnSO4·H2O、(NH4)6MoO2·4H2O、CuSO4·5H2O 等，PCR 試劑為 DNA Marker、Taq 酶及MBI PCR產物純化試劑盒;DNA及油脂提取試劑為丙酮、異丙醇、苯酚及甲醇等。

1.2 方法

1.2.1 球藻培養(yǎng) 采集的藻種用BG11培養(yǎng)液稀釋后涂BG11固體平板，在25℃、光照周期為12 h:12 h、3 000 lx冷白熒光燈條件下培養(yǎng)。挑取單藻落平板上反復劃線分離;將藻接種到含1 mL BG11培養(yǎng)基的PE管，同等條件培養(yǎng)20 d，鏡檢確認;接種至50 mL BG11中，每天定時搖動，OD680達0.3以上，取10 mL用于藻種鑒定;按牛糞浸出液培養(yǎng)實驗設計要求，每實驗組接種1 mL藻種，培養(yǎng)4周，每周取樣3 mL，用于生長量測定，剩余用于藻類油脂提取。

1.2.2 18S rDNA序列分析 采用18S rDNA鑒定的方法確定經分離純化球藻的種屬。總DNA的提取采用CTAB法，Invitrogen公司提供并合成的PCR擴增上下浮引物，分別為18S－F:5'GCGCGGCTCATTAAATCAGTTATAG3'18S－R:5'，CCCTTGTTACGATTTCTCCTTCCTC3'，PCR 反應條件為 94℃ 變性3 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產物再進行純化并測序。18S rDNA序列在GenBank進行BLAST序列比對對藻種鑒定。

1.2.3 球藻及牛糞浸出液吸光度掃描 取1.5 mL藻液3 500 r/min、5 min離心，棄上清液，在沉淀中加入2.5 mL丙酮充分溶解，提取球藻中葉綠素，在BioMate 3S雙光束紫外光/可見光光譜儀上掃描其在300～800 nm吸光值，確定球藻生長量測量時所采用的波長。牛糞浸出液用蒸餾水作基線，將其按1∶9稀釋，在200～900 nm內進行掃描，確定其波長。

1.2.4 球藻生長速率測定 根據掃描結果，確定小球藻葉綠素有2個吸收峰，分別為波長660 nm和430 nm。每周收集1次樣品，測定其在2個波長的吸光值，根據公式統計各實驗組葉綠素A、葉綠素B及葉綠素總量的日均增長率等，球藻總葉綠素值 =OD660×8.02+OD430×20.21［4］。

1.2.5 球藻油脂提取 收集等量藻液，5 000 r/min、3 min離心，再用ddH2O洗滌2次，離心烘干稱重;經兩次－20℃ ～40℃凍融，加入5 mL的氯仿∶甲醇 (1∶2)溶劑萃取充分，加石油醚3 mL，60℃水浴60 min，離心過濾，水浴蒸發(fā)，105℃烘干冷卻后稱重，每組重復3次，數據統計，單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 18S rDNA 序列分析

經純化后采用CATB法提取小球藻全基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測質量合格(圖1);利用基因組 DNA及上下游引物進行PCR擴增，18S rDNA基因片段約為1.7 kb(圖2);經PCR產物純化試劑盒純化，并送上海生工進行測序，通過雙向測序，利用軟件進行序列拼接，最終獲得長度約為1.7 kb的球藻18S rDNA基因序列。通過BLAST程序獲得NCBI的GenBank數據庫18S rRNA基因與球藻相近的序列，確定比對結果，證明該小球藻屬于普通小球藻株。

圖1 小球藻基因組DNAFig.1 Chlorella vulgaris genome DNA

圖2 小球藻18S rDNA PCR產物Fig.2 Chlorella vulgaris 18S rDNA PCR product

2.2 牛糞浸出液培養(yǎng)球藻生長率測定

2.2.1 球藻和牛糞浸出液吸光度掃描 用丙酮提取的小球藻葉綠素在雙光束光度儀上波長掃描，發(fā)現球藻葉綠素在可見光范圍內有2個明顯吸收峰，分別在660 nm和430 nm(圖3)，根據掃描結果可以用660 nm和430 nm作為葉綠素吸光度的測定波長。利用蒸餾水為空白作基線，牛糞浸出液經掃描吸收峰位于200～350 nm，400～900 nm其峰值明顯降低，接近于0(圖4)，可知，牛糞浸出液培養(yǎng)球藻利用雙光束光度儀測定葉綠素吸光值不受干擾，且數據穩(wěn)定可靠。

圖3 球藻葉綠素光譜掃描Fig.3 Spectral scan on chlorophyll of Chlorella vulgaris

圖4 牛糞浸出液光譜掃描Fig.4 Spectral scan on extracts from cow dung

2.2.2 球藻培養(yǎng)生長率測定 利用牛糞浸出液培養(yǎng)球藻，共設6個試驗組，2個對照組，每周取樣1次，共取4次，利用雙光束光度儀在660 nm和430 nm 2個波長測定葉綠素吸光值，并分別記錄，根據公式計算球藻葉綠素總量，確定其生長率，結果見圖5。由此可見，利用牛糞浸出液進行球藻養(yǎng)殖其生長速度高于BG11培養(yǎng)劑，且差異明顯，同時發(fā)現高濃度牛糞浸出液抑制球藻生長，隨著其營養(yǎng)消耗濃度降低，球藻生長速度逐漸提高，這可能與球藻生長對有機物利用控制調節(jié)有關。球藻培養(yǎng)最適水與牛糞浸出液體積比為4∶6，培養(yǎng)周期為20 d左右。結果表明利用牛糞浸出液進行藻類培養(yǎng)是可行的。

2.3 異養(yǎng)球藻油脂含量測定

每個試驗組收集等量藻液，設3個平行組，經洗滌、萃取及烘干等處理，稱重并記錄數據，通過單因素方差分析，其結果見圖6。結果表明，利用牛糞浸出液培養(yǎng)球藻油脂含量明顯高于BG11對照組，差異顯著(P ＜0.05);試驗組(2∶8)、(1∶9)球藻后期生長量大，觀察呈絲狀而且相互粘在一起，可能導致萃取不充分，使得油脂提取得率下降;而試驗組(9∶1)、(8∶2)和(6∶4)球藻后期生長未出現上述現象，萃取充分，其油脂得率逐步升高，達0.57以上。利用與BG11培養(yǎng)的球藻相比，觀察發(fā)現牛糞浸出液培養(yǎng)的球藻呈深綠色，可以說明牛糞浸出液能提高球藻油脂得率，研究發(fā)現最佳適合球藻培養(yǎng)體積比為4∶6。這可能與球藻吸附培養(yǎng)液的脂肪有關。

圖5 牛糞浸出液培養(yǎng)球藻生長率曲線Fig.5 Growth rate curve of Chlorella vulgaris cultured by extracts from cow dung

圖6 各試驗組球藻提取油脂得率Fig.6 Lipid content graph extracted from Chlorella vulgaris in each test group

3 討論

微藻生物研究屬于生命科學研究領域的一個重要分支，是目前國內外研究的熱點。小球藻是人類最早分離培養(yǎng)的一種綠藻，其生態(tài)分布廣，適應性強且油脂含量較高，它的生長速度快，光合作用效率是一般高等植物的10倍左右。另外，小球藻在不同培養(yǎng)條件下可以產生10% ～30%細胞干重的脂類，可以用于轉化為脂肪酸甲脂即生產生物柴油，是目前研究生產生物柴油的熱點藻種之一［5－6］。本實驗藻種18S rDNA序列利用 BLAST程序分析表明球藻種18S rDNA基因序列與 Chlorella vulgaris sp.NIE21721最為接近，且僅有一個堿基替換，與另一種小球藻Chlorella vulgaris sp.CCAP260/11屬同一個分支，進一步可以確證他們之間存在很近的親緣關系，從而可以確定實驗藻種屬于普通小球藻。

自1953年Lewin等［7］首先發(fā)現了某些種類能利用有機物作為唯一碳源和能源進行異養(yǎng)生長以來，受到科學界廣泛重視。有研究表明，小球藻在只有無機鹽、維生素以及光作用的條件下就能正常生長，且光合效率高。但無機鹽培育的小球藻，由于營養(yǎng)鹽迅速消耗以及各種影響因素的干擾，在生產中極不穩(wěn)定。近年諸多研究者對小球藻異養(yǎng)的研究開始關注，當在培養(yǎng)液或培養(yǎng)基中含有葡萄糖等有機碳源時，小球藻的營養(yǎng)方式可以由自養(yǎng)轉變?yōu)楫愷B(yǎng)。高密度培養(yǎng)方式可以使小球藻的生長速度、密度細胞大幅度提高，而不受光限制［8］。異養(yǎng)條件下，小球藻細胞內油脂含量可達60%以上，可作為一種新型的油脂資源［1，9］。目前，國內外對牛糞進行了很多研究，證明牛糞具有廣泛的用途，如利用牛糞生產再生飼料、生產沼氣、發(fā)電及在木屑栽培平菇中的應用等［10］。對實驗原料牛糞進行的生化分析和研究中得出，在新鮮牛糞便中，水占83.2% ～83.36%，有機物占8.44% ～10.62%，灰分占5.2% ～6.18%，其中有機物成分主要為未消化的纖維素和蛋白質(水溶性蛋白質含量1.17% ～1.23%)等，pH值為7.5［11］。牛糞還有另外一些用途，其浸出液敷于小白鼠傷口，可促進其愈合效果［10］?？商剿骼门＜S為材料及發(fā)酵工程的方法大規(guī)模地生產微藻，為微藻內含物、生長及吸附等機理的研究提供基礎平臺。

大多數產油微藻的油脂組成與油料植物相似，脂肪酸多以C16和C18為主［12］，且多為飽和和單不飽和脂肪酸，小球藻也不例外［13］。本實驗利用牛糞浸出物培養(yǎng)球藻油脂得率高于BG11培養(yǎng)方式，可能是浸出物中多糖、脂類等經過次生代謝將脂類物質貯藏于液泡或細胞壁中，或通過吸附功能［14］將浸出液中的脂肪吸附細胞表面，也可能是缺N等環(huán)境脅迫等因素［15］，從而提高油脂含量，相關機理研究需要進一步研究證實。

本研究中主要優(yōu)化了牛糞浸出液培養(yǎng)微藻系統和產油率方面的關系，進一步可對牛糞浸出物中的有機物及N、P成分的含量進行測定，同時分析球藻脂肪組成，以探討球藻脂肪生成代謝調控，為提高球藻產油提供有力證據。

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