肉牛附紅細(xì)胞體PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

許蘭嬌，陶清松，黃志海，，瞿明仁，何后軍，萬 根*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江西 南昌 330045;2.江西省宜春市畜牧科學(xué)研究所，江西 宜春 336000)

肉牛附紅細(xì)胞體病是由溫氏附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon wenyonii)寄生于肉牛紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓等部位引起的一種人畜共患傳染病，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、貧血、黃疸為主。自 Schiling等［1］首次報(bào)道附紅細(xì)胞體病以來，該病已遍布了30多個(gè)國家和地區(qū)，目前中國大部分的地區(qū)都有動(dòng)物感染該病的報(bào)道［2］。

肉牛附紅細(xì)胞體病的發(fā)生與飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)密度、欄舍空氣質(zhì)量、環(huán)境變化、氣候變化等密切相關(guān)，多數(shù)情況下，溫氏附紅細(xì)胞體侵入機(jī)體呈隱性狀態(tài)，任何因素引起機(jī)體抵抗力下降時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致該病的發(fā)生［3］。近年來，中國肉牛產(chǎn)業(yè)在國家政策的指導(dǎo)下發(fā)展迅速，規(guī)模養(yǎng)牛場迅速增多，該病的報(bào)道也逐漸增多，如何防控人畜共患病的發(fā)生，促進(jìn)肉牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和消費(fèi)者的放心消費(fèi)，對(duì)肉牛附紅細(xì)胞體病進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的監(jiān)測是非常必要的。

目前，對(duì)附紅細(xì)胞體的臨床檢測仍然以鏡檢法為主，快速簡單，但是這種方法的缺點(diǎn)是特異性和敏感性低［4］，容易引起假陽性和假陰性［5］，導(dǎo)致臨床診斷失敗，附紅細(xì)胞體ELISA檢測試劑盒處于研發(fā)過程中，DNA探針技術(shù)、電鏡檢測等因試驗(yàn)條件或費(fèi)用昂貴等都不適合與臨床疾病診斷［6］。本試驗(yàn)通過建立一個(gè)簡單、快速、特異性好、敏感度高的肉牛附紅細(xì)胞體PCR檢測方法，對(duì)該病原的檢測做出快速準(zhǔn)確的判斷，有利于臨床上及時(shí)做出準(zhǔn)確的診斷。

1 材料與方法

1.1 臨床病料與處理

肉牛附紅細(xì)胞體DNA由江西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，陽性病料為江西省的某規(guī)模肉牛養(yǎng)殖廠無菌采集的5份附紅細(xì)胞體陽性血液樣品，加38 g/L的枸櫞酸鈉溶液抗凝，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室－80℃保存。

1.2 分子生物試劑

DNA PCR擴(kuò)增試劑盒，飽和酚、胃蛋白酶K、EB等購自大連寶生物公司，氯仿、無水乙醇、異戊醇、醋酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?，購自于江西碧源生物科技有限公司，DNA Marker DL1000購自大連寶生物公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的肉牛溫氏附紅細(xì)胞體的16S rRNA基因序列(序列號(hào):AY946266)，同時(shí)參考有關(guān)文獻(xiàn)，利用計(jì)算機(jī)輔助軟件primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性PCR引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長為412 bp。引物序列如下:

上游引物P1:5'－GATGGAGATCGCCTCCCTAG －3'

下游引物P2:5'－GCACCACCTGTCTTACTGATT －3'

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，稀釋成濃度為20 μmol/L，－20℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA 的提取

按照試劑盒操作說明提取肉牛附紅細(xì)胞體 DNA，加入20μL滅菌雙蒸水或TE溶液溶解，－20℃保存?zhèn)溆没蛄⒓词褂谩?/p>

1.5 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

PCR 反應(yīng)總體積為25 μL，組成如下:10 × PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，dNTP mixture 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，上游引物(P1)、下游引物(P2)各1 μL，Taq 酶0.5μL，雙蒸水16μL，將各組分混勻后進(jìn)入PCR循環(huán)。擴(kuò)增基因片段的參數(shù)設(shè)置為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性58 s，58℃退火45 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃再延伸10 min，反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀(PE9700)上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物，4℃保存。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplified results by PCR

圖2 特異性試驗(yàn)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplified results by PCR in Specific Test

圖3 敏感性試驗(yàn)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The amplified results by PCR in Sensitivity Test

2 結(jié)果分析

2.1 檢測結(jié)果

取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見用優(yōu)化后的PCR方法擴(kuò)增出了412 bp的核酸條帶，結(jié)果如圖1。

2.2 擴(kuò)增片段的特異性鑒定

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，基因序列全長為412 bp，并對(duì)其序列進(jìn)行同源性分析，與Genbank中溫氏附紅細(xì)胞體(序列號(hào):FJ375309)的同源性為98%以上。提取牛大腸桿菌、弓形體、胸膜肺炎放線桿菌DNA，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，顯示為陰性(圖2)，說明擴(kuò)增產(chǎn)物具有良好的特異性，用本試驗(yàn)建立的方法進(jìn)行臨床組織病料中附紅細(xì)胞體的檢測是可行的。

2.3 敏感性試驗(yàn)

用紫外分光光度計(jì)測定稀釋后的DNA的濃度為123 ng/μL，進(jìn)行10倍的連續(xù)稀釋，用上述PCR方法擴(kuò)增，結(jié)果顯示該P(yáng)CR方法可以檢測的最低DNA濃度為1.23 ng/μL(圖3)。

3 討論

(1)肉牛附紅細(xì)胞體病是一種人畜共患病，它不僅危害動(dòng)物的健康，引起動(dòng)物發(fā)生疾病和死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重危害人類的健康。附紅細(xì)胞體的傳播途徑多，可通過血液昆蟲(如:蚊子、蒼蠅、蜱等)、傷口、注射器等感染動(dòng)物和人［7］。近年來，人感染附紅細(xì)胞體的報(bào)道不斷增多，并呈現(xiàn)上升的趨勢，已引起醫(yī)學(xué)界和畜牧工作者的高度關(guān)注［8－12］。由于診斷方法的局限性，一些流行病學(xué)特點(diǎn)難以觀察和掌握，因此用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)肉牛附紅細(xì)胞體病進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測，對(duì)提高該病診斷的準(zhǔn)確性具有重大意義。

(2)中國肉牛產(chǎn)業(yè)正處于一個(gè)蓬勃發(fā)展階段，對(duì)肉牛各種流行疾病做出快速準(zhǔn)確的判斷，有利于產(chǎn)業(yè)的良好發(fā)展。目前國內(nèi)對(duì)附紅細(xì)胞體的診斷方法主要以鏡檢法和血涂片法為主，而該方法在操作過程中常常會(huì)引起紅細(xì)胞的變形而導(dǎo)致誤診［13－14］。本試驗(yàn)建立的肉牛附紅細(xì)胞體PCR檢測方法的擴(kuò)增產(chǎn)物序列與Genbank中公布的牛溫氏附紅細(xì)胞體的序列比較，同源性98%;通過提取牛大腸桿菌、弓形體、胸膜肺炎放線桿菌的DNA并進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性;能夠檢測的最低DNA濃度為1.23 ng/μL。說明本試驗(yàn)所建立的PCR方法具有良好的特異性和敏感性。通過對(duì)陽性血樣的檢測，結(jié)果準(zhǔn)確性良好，表明所建立的PCR方法在臨床上對(duì)肉牛附紅細(xì)胞體病能做出快速準(zhǔn)確的判斷。

(3)國外研究人員對(duì)附紅細(xì)胞體分子生物學(xué)方面的研究較早［15］。國內(nèi)關(guān)于牛附紅細(xì)胞體分子生物學(xué)方面的研究近年來也有報(bào)道，重點(diǎn)傾向于牛附紅細(xì)胞體的鑒定歸類［16］，肉牛附紅細(xì)胞體病原的PCR檢測方法未見報(bào)道。當(dāng)前，中國肉牛產(chǎn)業(yè)處于快速發(fā)展時(shí)期，做好肉牛的人畜共患病的監(jiān)測與防控，為市場提供安全放心牛肉具有重大意義。本試驗(yàn)建立的肉牛附紅細(xì)胞體PCR檢測方法操作簡單快速、特異性好、敏感度高，8 h之內(nèi)可得出結(jié)果，克服了以往方法的缺點(diǎn)，為該人畜共患病的臨床監(jiān)測和診斷提供了新的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，也符合當(dāng)前人畜共患病快速診斷的需求，同時(shí)也極大地豐富了附紅細(xì)胞體的流行病學(xué)及獸醫(yī)臨床診斷學(xué)等方面的知識(shí)內(nèi)容。

［1］Kerier J P.Parasitic Protozoa［M］.New York:Academic Press，1977:251 －294.

［2］王永，馮昕煒，嚴(yán)光文，等.附紅細(xì)胞體病原學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(6):491－495.

［3］張瑞光.豬附紅細(xì)胞體病并發(fā)鏈球菌病的診治［J］.中國動(dòng)物檢疫，2002，19(9):36.

［4］Hoelzle L E，Adelt D，Hoelzle K，et al.Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection of Mycoplasma suis(Eperythrozoon suis)in porcine blood［J］.Vet Microbiol，2003，93(3):185 －196.

［5］McAuliffe L，Lawes J，Bel1 S，et al.The detection of Mycoplasma(formerly Eperythrozoon)wenyonii by 16S rDNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis［J］.Vet Microbiol，2006，117(2/4):292 － 296.

［6］楊猛，崔成都，劉德成，等.附紅細(xì)胞體檢測技術(shù)的研究現(xiàn)狀［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27(增):19－21.

［7］韓子強(qiáng)，楊宏軍，李建基.動(dòng)物附紅細(xì)胞體病的研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2002，19(7):21－24.

［8］李雪梅，王惠萱，王珂.成人附紅細(xì)胞體病白細(xì)胞升高1例報(bào)道［J］.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008(4):196－197.

［9］朱明，謝漢國，劉蘭香，等.成人附紅細(xì)胞體病高熱及腹瀉一例［J］.中華內(nèi)科雜志，2005，44(10):35.

［10］秦先章，叢培芳，張淑麗，等.動(dòng)物檢疫人員附紅細(xì)胞體病一例［J］.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2003，21(6):476－477.

［11］謝漢國，朱明，李莉莎，等.福建省首例人附紅細(xì)胞體病報(bào)告［J］.中國人獸共患病雜志，2005，21(4):364－365.

［12］張敏娟，凌學(xué)靜，馮月梅.銀川市居民和門診病人附紅細(xì)胞體感染情況分析［J］.寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，200224(1):60－61.

［13］楊傲冰，梁昭平，周秀蓉，等.豬附紅細(xì)胞體病的調(diào)查及診治［J］.中國獸醫(yī)科技，2002，32(9):30.

［14］黃占欣，米同國，趙霞.邯鄲地區(qū)奶牛附紅細(xì)胞體病的流行病學(xué)調(diào)查［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40(9):133－135.

［15］Gwaltney S M，Hays M P，Oberst R D.Detection of Eperythozoon suis using the polymerase chain reaction［J］.J Vet Diagn Invest，1993(5):40 －46.

［16］周作勇，聶奎，胡世君，等.牛附紅細(xì)胞體16SrRNA基因的克隆測序及分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31(3):329－341.