一株產(chǎn)紫杉醇的南方紅豆杉內(nèi)生菌的分離與鑒定

李昆太，彭衛(wèi)福，周 佳，黃 林，程 新

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045)

紫杉醇(paclitaxel，商品名taxol)系三環(huán)二萜類生物堿［1］，是當(dāng)今世界公認(rèn)的廣譜、療效確切的天然抗癌藥物。早在1971年，美國(guó)化學(xué)家Wani等［2］最先從太平洋短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)的樹皮中分離提取到紫杉醇。由于紫杉醇在樹皮中的含量極低(平均產(chǎn)量約0.015%)［3］，使得傳統(tǒng)的從紅豆杉植株中直接提取紫杉醇的方式受到了極大的限制和挑戰(zhàn)。因此，如何尋求到新的藥源途徑來生產(chǎn)紫杉醇，成為了國(guó)內(nèi)外藥學(xué)界急需解決的課題。

植物內(nèi)生菌在與宿主植物長(zhǎng)期共進(jìn)化過程中，可產(chǎn)生一系列具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲等作用的生物活性物質(zhì)［4－6］。因此，從植物內(nèi)生菌中尋找并開發(fā)新的生物活性物質(zhì)，正成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。1993年，Stierle等［7］首次從短葉紅豆杉中分離到一株能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌紫杉霉(Taxomyces andreanae)，該發(fā)現(xiàn)極大地激發(fā)了國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生菌的研究熱潮。

本文以南方紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)植株為材料，從中分離篩選到1株具有產(chǎn)紫杉醇能力的內(nèi)生真菌，并通過菌株形態(tài)學(xué)觀察以及18S rRNA序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

搖床、離心機(jī)、培養(yǎng)箱、電子天平、高效液相色譜儀、超聲波細(xì)胞破碎儀等。

1.2 材料

供試植物為采自于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥園的南方紅豆杉新鮮樹枝，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物工程有限公司)，牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 內(nèi)生菌分離平板培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯(去皮煮汁，過濾取液)200;葡萄糖20;瓊脂20;pH自然。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5;蛋白胨10;氯化鈉5;瓊脂20;pH 7.0～7.2。高氏一號(hào)培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉 20;KNO31;K2HPO40.5;MgSO4·7H2O 0.5;NaCl 0.5;FeSO4·7H2O 0.01;瓊脂20;pH 7.2 ～7.4。

1.3.2 內(nèi)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 馬鈴薯(去皮煮汁，過濾取液)200;葡萄糖10;蔗糖10;硫酸鎂0.15;乙酸鈉1.0;苯丙氨酸0.02;pH自然。

1.3.3 內(nèi)生菌鑒定培養(yǎng)基 察氏培養(yǎng)基(g/L):硝酸鈉3.0;磷酸氫二鉀1.0;硫酸鎂0.5;氯化鉀 0.5;硫酸亞鐵0.01;蔗糖30;瓊脂20;pH自然。

1.4 內(nèi)生菌的分離純化

采用組織塊法對(duì)南方紅豆杉內(nèi)生菌進(jìn)行分離［8］。將采集的新鮮南方紅豆杉莖表面以無菌水沖洗干凈，在無菌操作室中用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精溶液浸泡3 min，以無菌水沖洗4至5次，然后用體積分?jǐn)?shù)0.1%升汞溶液浸泡3 min，再用無菌水沖洗4～5次。將經(jīng)上述處理的材料按無菌操作技術(shù)，切成0.5 cm×0.5 cm的小段，分別覆蓋接種至PDA、牛肉膏蛋白胨、高氏一號(hào)等分離培養(yǎng)基平板上，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)觀察到組織塊邊緣有絲狀真菌長(zhǎng)出后，及時(shí)將邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化。

1.5 內(nèi)生菌產(chǎn)紫杉醇的鑒定

1.5.1 內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法 每支內(nèi)生真菌的新鮮斜面以10 mL無菌水洗下菌絲體，打碎均勻制成菌懸液。吸取1 mL菌懸液接至裝量為50 mL/250 mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)7 d。

1.5.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵液的預(yù)處理［9］搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，用干凈的4層紗布過濾發(fā)酵液，分別收集濾液和菌絲體。濾液用等體積的二氯甲烷萃取2次，每次1 h，合并二氯甲烷萃取相，加入無水硫酸鈉干燥，過濾后35℃下以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，得到粗提物Ⅰ;菌絲體反復(fù)凍融3次后，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體(可涂片在顯微鏡下觀察菌絲破碎與否)，加入30 mL甲醇浸提1 h，過濾后，35℃下以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，得到粗提物Ⅱ;粗提物Ⅰ和Ⅱ合并，以5 mL甲醇溶解后，用薄層層析和HPLC法進(jìn)行紫杉醇的鑒定。

1.5.3 薄層層析(TLC)鑒定法 用毛細(xì)吸管吸取內(nèi)生真菌發(fā)酵液的處理液，點(diǎn)樣于硅膠G板(50 mm×100 mm，使用前放入105℃烘燥箱中活化30 min)的底部，以紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液為對(duì)照。點(diǎn)樣后，用甲醇∶氯仿=1∶7(V/V)的混合液為展開劑進(jìn)行展層，展層結(jié)束后以飽和碘蒸氣進(jìn)行斑點(diǎn)的顯色。

1.5.4 HPLC 鑒定法 高效液相系統(tǒng):Aglient 1100 HPLC;色譜柱:Kromasil C18 column(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:H2O/乙腈 =5/5(v/v);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):227 nm;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

1.6 內(nèi)生菌的分類鑒定

1.6.1 菌株形態(tài)特征觀察［10］經(jīng)薄層層析與HPLC法確定產(chǎn)紫杉醇類物質(zhì)的內(nèi)生真菌，在察氏培養(yǎng)基上分別采用點(diǎn)植培養(yǎng)法、載片培養(yǎng)觀察法以及插片法觀察菌落、菌絲體和孢子的形態(tài)特征，該菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.6.2 18S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 以內(nèi)生真菌的基因組DNA為模板，用NS1(5'－GTAGTCATATGCTTGTCTC－3')和NS6(5'－GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC－3')為18S rRNA上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將得到的18S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，下載同源性較高的序列，保存成FASTA格式的文件，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 南方紅豆杉內(nèi)生菌的分離及其發(fā)酵產(chǎn)物的初步鑒定

以南方紅豆杉植株的莖部為材料，從中分離純化得到5株內(nèi)生真菌，初步命名為紅莖－1、紅莖－2、紅莖－3、紅莖－4、紅莖－5。將這5株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液處理物首先進(jìn)行TLC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅莖－3的發(fā)酵液處理物與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的比移值(Rf≈0.93)和顏色相近的顯色斑點(diǎn)(圖1)，這初步表明紅莖-3可能具有產(chǎn)紫杉醇的能力。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證紅莖－3能否產(chǎn)紫杉醇，將其發(fā)酵液處理物與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，二者的HPLC圖譜如圖2所示。

由圖2可以看出，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品和紅莖-3的發(fā)酵液浸提物具有相同保留時(shí)間的洗脫峰，二者均在3.1 min左右。綜合紅莖－3發(fā)酵液浸提物以及紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的TLC和HPLC分析，可以初步判定紅莖－3具有發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的能力。需要說明的是，盡管初步判定了紅莖－3具有產(chǎn)紫杉醇的能力，但是還需進(jìn)一步對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并借助紫外光譜、質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振等技術(shù)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

圖1 紅莖－3發(fā)酵液處理物與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的薄層層析比較Fig.1 The TLC comparison between Red stem －3 fermentation broths with standard paclitaxel

圖2 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(a)與紅莖－3發(fā)酵液處理物(b)的HPLC圖譜Fig.2 The HPLC figures of standard paclitaxel(a)and Red stem －3 fermentation broths(b)

2.2 紅莖－3的菌種鑒定

2.2.1 紅莖－3的菌株形態(tài)特征觀察 紅莖－3菌株點(diǎn)植于察氏培養(yǎng)基平板上，菌絲生長(zhǎng)速率快，培養(yǎng)2 d后菌落直徑可達(dá)6 cm左右，3 d可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿。菌落在前3 d呈白色絨毛狀，后期轉(zhuǎn)變成深褐色，如圖3所示。借助插片法和載片法對(duì)紅莖－3的菌絲和分生孢子形態(tài)進(jìn)行顯微觀察，可以看出紅莖－3菌絲發(fā)達(dá)呈交織的分支狀(圖4a)，菌絲有橫隔(圖4b)，分生孢子呈橢圓形且緊密聚集形成子囊殼結(jié)構(gòu)(圖4c)。

根據(jù)以上形態(tài)特征觀察，可初步鑒定紅莖－3為子囊菌亞門的核菌綱。

2.2.2 紅莖－3的18S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 將紅莖－3(IS279)的18S rRNA序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行BLAST相似性搜索，收集相似性較高的序列，利用MEGA 4.0軟件，Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示。

圖3 紅莖-3的菌落形態(tài)特征Fig.3 The morphologic colony of Red stem-3(culture for 48 h)

由圖5可以看出，紅莖－3與間座殼屬 2個(gè)菌株(Diaporthe sp.MI 02和Diaporthe sp.MI 03)聚類在同一個(gè)分支上，序列同源性為99%。根據(jù)紅莖－3的形態(tài)和生物學(xué)特征，及其序列同源性比較的結(jié)果，內(nèi)生菌紅莖－3菌株可鑒定為間座殼屬(Diaporthe sp.)，并初步命名為Diaporthe sp.H-3。

3 討論

圖4 紅莖-3的菌絲體及孢子形態(tài)圖Fig.4 The morphologic hyphal and acervulus of endophyte Red stem-3

目前的紫杉醇生產(chǎn)技術(shù)，即從紅豆杉原料中直接提取紫杉醇或其中間體的方法，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。由于微生物發(fā)酵法具有菌體生長(zhǎng)快、發(fā)酵周期短、產(chǎn)物產(chǎn)率高、生產(chǎn)成本低且發(fā)酵過程易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制等諸多優(yōu)勢(shì)，因此利用植物內(nèi)生真菌工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇或中間體，是解決這個(gè)問題的有效途徑。

到目前為止，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的從紅豆杉屬植物中分離到的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌多達(dá)20多個(gè)屬，且多以霉菌為主，如 Taxomyces andreanae(紫杉霉屬)、Fusarium lateritum(鐮刀霉屬)、Alternariu sp.(交鏈霉屬)、Pestalotiopsis micropora(盤多拉毛霉屬)、Nodulisporium sylviform(多節(jié)孢屬)等［11－12］。除了紅豆杉屬植物外，從非紅豆杉屬植物中，如木橘［13］、榧樹［14］、夾竹桃［15］、柏樹［16］等，也分離篩選到了可產(chǎn)紫杉醇的各種內(nèi)生真菌。這充分說明了紫杉醇產(chǎn)生菌具有生物多樣性，同時(shí)也顯示了紫杉醇產(chǎn)生菌宿主的生物多樣性。

迄今，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者不僅在產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生菌的分離篩選方面做了大量的工作，而且就產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生菌的菌種選育及其發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面也進(jìn)行了大量研究［17－19］。盡管利用內(nèi)生真菌進(jìn)行紫杉醇的發(fā)酵生產(chǎn)已顯示出誘人的前景和巨大的潛力，而且借助高產(chǎn)菌種的選育、發(fā)酵條件的優(yōu)化等手段使得內(nèi)生菌產(chǎn)紫杉醇的能力得到了大幅度的提高，但是這些研究大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，目前仍難以實(shí)現(xiàn)中型或大型工業(yè)化規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)［20］。究其原因，還在于缺乏適合于工業(yè)化的高產(chǎn)菌株。因此，尋找高產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生菌株并建立合適的發(fā)酵工藝控制路線，仍然是今后的重點(diǎn)研究方向。

圖5 紅莖-3的18S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 The phylognetic tree of Red stem-3 18S rRNA sequences

本文以南方紅豆杉植株為材料開展了內(nèi)生菌的分離篩選，并最終獲得一株具有產(chǎn)紫杉醇能力的內(nèi)生真菌Diaporthe sp.H-3。值得注意的是，目前有關(guān)間座殼屬內(nèi)生菌產(chǎn)紫杉醇的報(bào)道尚屬首次，但Diaporthe sp.H-3發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的潛能還有待進(jìn)一步的研究。

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