游動放線菌原生質(zhì)體誘變選育阿卡波糖高產(chǎn)菌株*

王遠(yuǎn)山，牛鑫淼，鄭裕國

1(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

2(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州，310014)

阿卡波糖(acarbose)是一種低聚糖，由環(huán)己烯醇氨(valienamine)，4-氨基-4，6-雙脫氧葡萄糖和麥芽糖組成［1］。它還是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，能夠有效抑制腸道內(nèi)的某些消化酶，降低餐后的血糖水平，主要用于治療Ⅱ型糖尿病，具有毒副作用小、作用溫和持久等優(yōu)點(diǎn)［2］。阿卡波糖最早由游動放線菌Actinoplanes sp. SE50、SE82 和SE18 的代謝產(chǎn)物中分離出來，并于1990 年由德國Bayer 公司生產(chǎn)上市，目前已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。

目前，阿卡波糖的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)均通過游動放線菌發(fā)酵獲得［3］，菌株的生產(chǎn)能力很關(guān)鍵，因此很多研究工作都集中于菌株的選育和發(fā)酵優(yōu)化。程新等［4－5］從土壤中篩選到1 株游動放線菌Actinoplanes sp. A56，經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化后阿卡波糖產(chǎn)量達(dá)到了1 043 mg/L。朱皖宜等［6］利用紫外和培養(yǎng)基中添加麥芽糖的誘變模式，獲得了較出發(fā)菌株提高74%的突變株。張琴等［7］采用紫外、亞硝基胍、硫酸二乙酯和亞硝酸多次誘變，篩選到的突變株發(fā)酵水平提高了35%。Wang 等［8－9］通過對發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化使得阿卡波糖的產(chǎn)量達(dá)到4 210 mg/L，而且在發(fā)酵不同時(shí)間補(bǔ)加葡萄糖、麥芽糖和黃豆餅粉混合物，阿卡波糖的產(chǎn)量提高到了4 878 mg/L。隨著原生質(zhì)體技術(shù)的發(fā)展，原生質(zhì)體誘變技術(shù)被廣泛應(yīng)用于菌株的育種。由于原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁，對各種物理化學(xué)誘變較敏感，而又具有細(xì)胞的全能性及再生能力，所以是理想的誘變材料［10］。除了原生質(zhì)體誘變外，以原生質(zhì)體融合為基礎(chǔ)的基因組重排技術(shù)也得到了廣泛的應(yīng)用，但是利用原生質(zhì)體技術(shù)選育阿卡波糖高產(chǎn)菌株的報(bào)道相對較少。馬妮［11］通過原生質(zhì)體紫外、NTG誘變結(jié)合甲胺、麥芽糖耐受模型篩選得到1 株產(chǎn)量達(dá)3 700 mg/L 的突變株。鄭斐［12］利用基因組重排技術(shù)得到的阿卡波糖高產(chǎn)融合子產(chǎn)量達(dá)到3 714 mg/L。

本實(shí)驗(yàn)對Actinoplanes utahensisZJB-08196 原生質(zhì)體制備再生條件進(jìn)行了研究，再對其原生質(zhì)體進(jìn)行了紫外誘變，取得了良好的效果。此外，原生質(zhì)體制備再生也是基因組重排技術(shù)中非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容也為進(jìn)一步通過基因組重排技術(shù)選育阿卡波糖高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

猶他游動放線菌(Actinoplanes utahensis)ZJB-08196，浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基CPC(g/L):蔗糖30，蛋白胨2，酪氨酸1，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，瓊脂20，pH 自然。

菌絲培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，酵母粉3，蛋白胨30，黃豆餅粉5，淀粉0.5，MgSO42，K2HPO40.5，pH 7.0。

再生培養(yǎng)基:R2YE 培養(yǎng)基［13］。

種子培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉16，黃豆餅粉40，甘油20，CaCO32，K2HPO40.5，pH 自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):麥芽糖漿271.4 mL，葡萄糖40，黃豆餅粉17，谷氨酸鈉5，F(xiàn)eCI30.5，CaCO32.5，CaCl21.88，K2HPO41，甘油5，pH 6.5 ～7.0。

1.2.3 試劑

P 緩沖液:見參考文獻(xiàn)［13］;溶菌酶，購自Sigma 公司;牛血清白蛋白(BSA)，購自上海聚源生物科技有限公司;L-脯氨酸，購自上海青析化工科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)，購自汕頭市隴西化工廠;麥芽糖漿，由杭州中美華東制藥有限公司提供;乙腈，為色譜純;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.4 儀器

SBA 40 E 生物傳感器(山東微生物研究所);Osmometer Modal 3205 全自動冰點(diǎn)滲透壓儀(Advanced);LC-10AT 型高效液相色譜儀及SPD-10A 檢測器(Shimadzu)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng)及收集

從茄形瓶固體培養(yǎng)基上挑取1 cm2大小的菌落接種到菌絲培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)56 h 后，取6 mL 轉(zhuǎn)接到含甘氨酸的菌絲培養(yǎng)基(30 mL/250 mL 三角瓶)中進(jìn)行二級培養(yǎng)。將二級培養(yǎng)液3 500 r/min 離心10 min 收集菌體，菌體首先用無菌水洗滌1 次，再用P緩沖液洗滌2 次，待用。

1.2.2 原生質(zhì)體制備及再生

先將收集到的菌絲稱重，根據(jù)菌絲體濕重加入適量的溶菌酶溶液，混合均勻。35 ℃恒溫水浴，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，每隔30 min 吸取酶解液并用相差顯微鏡觀察原生質(zhì)體釋放情況。酶解結(jié)束后，用脫脂棉純化原生質(zhì)體，3 500 r/min 離心10 min 收集原生質(zhì)體，最后用P 緩沖液洗滌2 次。

將制備好的原生質(zhì)體懸液，用P 緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，輕輕涂布于固體再生培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5d，菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算原生質(zhì)體形成率和再生率。

式中，A:總菌落數(shù)，酶處理之前的菌懸液涂布于CPC 平板生長的菌落。

B:未原生質(zhì)體化菌落，酶解結(jié)束后，酶解混合液用蒸餾水稀釋，涂布CPC 平板生長的菌落。

C:再生菌落，純化后的原生質(zhì)體經(jīng)P 緩沖液稀釋，涂布于再生培養(yǎng)基平板生長的菌落。

1.2.3 原生質(zhì)體顯微鏡計(jì)數(shù)方法

用規(guī)格為25 cm×16 cm 的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在相差顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。

1.2.4 干重和濕重測量方法

準(zhǔn)確取10 mL 培養(yǎng)液于離心管，3 500 r/min 離心10 min，棄掉上清液，于90 ℃烘箱中烘干至恒重，稱量干重，每樣做3 個(gè)平行，取均值。

準(zhǔn)確取10 mL 培養(yǎng)液于離心管，3 500 r/min 離心10 min，棄掉上清液，稱量濕重，每樣做3 個(gè)平行，取均值。

1.2.5 原生質(zhì)體紫外誘變

將原生質(zhì)體懸液的濃度調(diào)整為106個(gè)/mL，取5 mL 懸液于直徑6 cm 的平板中，放置于2 根8 W 的紫外燈管下30 cm 處進(jìn)行誘變。分別照射40、60、80、100、120 s，黑暗放置2 h 后，涂布再生培養(yǎng)基于28 ℃恒溫再生。

致死率計(jì)算。根據(jù)各誘變組再生菌落數(shù)(M)和對照組再生菌落數(shù)(N)，計(jì)算不同誘變時(shí)間處理后的致死率:

1.2.6 高產(chǎn)突變株篩選

再生菌落先轉(zhuǎn)接于茄形瓶，再從茄形瓶中挑取1 cm2大小的菌落接種于100 mL 種子培養(yǎng)基中28 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，以10%轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接于50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d，取樣測定阿卡波糖含量。

1.2.7 檢測方法

發(fā)酵液滲透壓測定:發(fā)酵液12 000 r/min 離心10 min，取上清液250 μL 測定滲透壓。

葡萄糖測定:生物傳感器檢測［8］。

阿卡波糖檢測:HPLC 檢測［14］。色譜柱Luna NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:乙腈-磷酸鹽緩沖液(75 ∶25);檢測波長210 nm，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘氨酸對菌絲生長和原生質(zhì)體形成的影響

在放線菌的菌絲培養(yǎng)過程中添加甘氨酸，可以增加溶菌酶對菌絲細(xì)胞壁的敏感性。因?yàn)楦拾彼嵩诜啪€菌細(xì)胞壁合成過程中，甘氨酸可以代替結(jié)構(gòu)相似的丙氨酸從而干擾細(xì)胞壁的正常合成，有助于溶菌酶瓦解細(xì)胞壁。而甘氨酸的加入時(shí)間各異，有的放線菌需要?jiǎng)傞_始培養(yǎng)時(shí)就加入［15］，有的放線菌則在對數(shù)期再加入，然后繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間，才能達(dá)到理想的酶解效果。圖1 是菌絲培養(yǎng)初始就加入不同濃度的甘氨酸對菌株生長曲線的影響，并以不加甘氨酸為對照。從圖中可以看出，甘氨酸對ZJB-08196 的抑制非常明顯，當(dāng)甘氨酸的濃度為3 g/L 時(shí)，菌株生長已經(jīng)受到強(qiáng)烈的抑制，而濃度增加到5 g/L 時(shí)，幾乎已經(jīng)無法生長。從對照組的生長趨勢可以看出，菌體生長過程中適應(yīng)期較長，如果初始就加入甘氨酸，則菌體在適應(yīng)期就會受到抑制，從而顯著地影響后續(xù)生長，不能獲得原生質(zhì)體制備所需足量的菌體。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇二級培養(yǎng)的方式進(jìn)行菌體培養(yǎng)，即菌體一級培養(yǎng)56 h 左右到達(dá)對數(shù)生長后期，再以20%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接到含甘氨酸的新鮮菌絲培養(yǎng)基中進(jìn)行二級培養(yǎng)。

圖1 不同濃度甘氨酸濃度下ZJB-08196的一級生長曲線Fig.1 Growth curves of ZJB-08196 in first stage of different glycine concentration

放線菌通常以甘氨酸和溶菌酶配合使用來制備原生質(zhì)體，但是不同的品系所需的甘氨酸濃度差別較大，濃度從1 g/L 到15 g/L 都有報(bào)道［16］。表1 顯示的是二級培養(yǎng)時(shí)不同濃度的甘氨酸對菌體生長和原生質(zhì)體釋放的影響。為了便于直接比較，酶解時(shí)菌體(濕菌體)質(zhì)量濃度都調(diào)整為0.1 g/mL。從表中可知，當(dāng)甘氨酸濃度為4 g/L 時(shí)，酶解得到的原生質(zhì)體數(shù)最大達(dá)到2.88 ×107個(gè)/mL。

2.2 菌齡對原生質(zhì)體形成和再生的影響

不同生長階段的菌體對溶菌酶的敏感性是不同的，而且由于生理活性的差異也會導(dǎo)致再生效果的不同。一般原生質(zhì)體的制備選擇處于對數(shù)生長中后期的菌體，這是由于此階段的菌體細(xì)胞壁中的肽聚糖含量較低，對溶菌酶的作用最敏感，而且原生質(zhì)體修復(fù)能力也較強(qiáng)，再生效果好。而對數(shù)生長早期的菌體相對脆弱，酶的過度作用會影響原生質(zhì)體的再生［17］。圖2 是菌體在含4 g/L 甘氨酸菌絲培養(yǎng)基中的二級生長曲線，從圖中可以看出，菌體在24 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期。圖3 是菌絲二級培養(yǎng)時(shí)間對原生質(zhì)體形成和再生的影響，可以看出，原生質(zhì)體的形成率隨菌齡的增加緩慢增加，在20 h 處達(dá)到最大，隨后下降。再生率趨勢與形成率基本一致，但是在22 h 達(dá)到最大值。綜合考慮形成率與再生率，菌體的最佳菌齡為22 h。而22 h 是菌體生長的對數(shù)后期，這表明處于對數(shù)生長后期的菌體最適合制備原生質(zhì)體。已有過文獻(xiàn)報(bào)道，處于對數(shù)后期或穩(wěn)定期的放線菌菌體制備的原生質(zhì)體有較高的再生能力［18］。

表1 不同濃度甘氨酸對菌絲生長和原生質(zhì)體形成的影響Table 1 The effect of glycine concentration on mycelial growth and protoplast formation

圖2 ZJB-08196 的二級生長曲線Fig.2 Growth curves of ZJB-08196 in second stage

2.3 酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度和菌體(濕菌體)質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體的形成和再生的影響

細(xì)菌和放線菌細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖，可以用溶菌酶來水解細(xì)胞壁。由于不同菌種品系的細(xì)胞壁各組分比例以及生理狀態(tài)的差異，還有酶自身的純度及性質(zhì)的不同，所以要求的酶濃度以及酶解時(shí)間不盡相同。用于水解細(xì)胞壁的酶濃度過低，水解緩慢，不利于原生質(zhì)體的形成，而濃度過高，處理時(shí)間過長，菌體表面的細(xì)胞壁水解太徹底，又會影響原生質(zhì)體的活性，致使再生率下降。從圖4 －A 酶濃度對原生質(zhì)體形成和再生影響可以看出，隨著酶濃度的增加，原生質(zhì)體的形成率逐漸增加，再生率則在10 mg/mL 達(dá)到最大值，綜合考慮形成率和再生率，最佳的酶濃度為10 mg/mL。酶解溫度要兼顧酶的活力和對原生質(zhì)體活性的影響。文獻(xiàn)報(bào)道放線菌的最適酶解溫度一般在30 ℃到37 ℃之間［19］。從圖4 －B 可以看出，原生質(zhì)體的形成率和制備率同時(shí)在35 ℃時(shí)達(dá)到最大，所以酶解的最適溫度為35 ℃。從圖4 －C 的酶解時(shí)長對原生質(zhì)體形成和再生影響可以看出，雖然酶解時(shí)間越長形成率越高，但是超過4 h 后，原生質(zhì)體的再生率顯著下降，所以最終選擇4 h 為酶解時(shí)長。

在確定的酶濃度、酶解時(shí)間及酶解溫度條件下，酶解液中菌體的質(zhì)量濃度也會影響原生質(zhì)體的形成和再生，所以酶解時(shí)混合液中的菌絲體量要加以控制。如圖4 －D 所示，菌體濃度小于0.2 g/mL 時(shí)，原生質(zhì)體的形成率下降幅度并不顯著，而再生率則逐漸增大，在0.2 g/mL 左右時(shí)達(dá)到最大，所以最佳的菌體質(zhì)量濃度為0.2 g/mL 左右。

圖3 菌齡對原生質(zhì)體形成和再生的影響Fig.3 The effect of mycelium age on protoplast formation and regeneration

圖4 溶菌酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間和菌體濃度對原生質(zhì)體形成和再生的影響。Fig. 4 The effect of lysozyme concentration，enzymolysis time，enzymolysis temperature and mycelial concentration on protoplast formation and regeneration

2.4 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1L-脯氨酸對再生的影響

L-脯氨酸是再生培養(yǎng)基中非常重要的組成成分，可以用來合成細(xì)胞壁中肽聚糖，促進(jìn)原生質(zhì)體的再生。從表2 中可知，當(dāng)L-脯氨酸的濃度達(dá)到4 g/L時(shí)，再生率最高達(dá)到10.6%，繼續(xù)增加L-脯氨酸的濃度，再生率反而下降，因此最佳的L-脯氨酸濃度為4 g/L。

表2 再生培養(yǎng)基中L 脯氨酸濃度對原生質(zhì)體再生的影響Table 2 The effect of L-proline concentration of regeneration medium on protoplast regeneration

2.4.2 BSA 和PVP 對再生的影響

BSA 一方面對原生質(zhì)體起保護(hù)作用，可以保持原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)和功能的完整性［20］。另一方面，BSA 也是一種營養(yǎng)物質(zhì)，可以通過代謝轉(zhuǎn)化為細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì)，加速細(xì)胞壁的再生。如表3 所示，在再生培養(yǎng)基中添加BSA 可有效提高再生率，當(dāng)BSA 濃度達(dá)到0.3 g/L 時(shí)，再生率最高達(dá)到15.41%。

PVP 也是一種原生質(zhì)體的保護(hù)劑，可以給原生質(zhì)體提供穩(wěn)定的代謝環(huán)境，促進(jìn)原生質(zhì)體的再生。如表3 所示，再生培養(yǎng)基中加入PVP 也可以提高原生質(zhì)體的再生率，當(dāng)濃度達(dá)到0.2 g/L 時(shí)，再生率最高為15.14%。從結(jié)果來看，添加BSA 后的最大再生率要稍高于PVP，但是BSA 價(jià)格較PVP 要高，結(jié)合經(jīng)濟(jì)性來考慮，PVP 是BSA 的良好替代品。

表3 再生培養(yǎng)基中BSA 和PVP 對原生質(zhì)體再生影響Table 3 The effect of BSA and PVP of regeneration medium on protoplast regeneration

2.5 原生質(zhì)體紫外誘變突變株篩選

原生質(zhì)體紫外誘變致死曲線如圖5 所示，原生質(zhì)體的致死率隨時(shí)間的延長迅速增加，當(dāng)紫外照射時(shí)間為60 s 時(shí)，致死率為74.9%，當(dāng)時(shí)間達(dá)到100 s 時(shí)，致死率已經(jīng)達(dá)到95.5%，照射120 s 后原生質(zhì)體的致死率達(dá)到100%。原生質(zhì)體的致死率在40 s 到60 s 時(shí)段內(nèi)變化幅度較大，這表明在此階段紫外照射的影響最大。

圖5 不同紫外誘變時(shí)間原生質(zhì)體致死率Fig.5 The lethality rate of protoplasts treated for different mutation time

從再生平板中挑取55 株誘變株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。挑選出了7 株阿卡波糖產(chǎn)量提高10%的突變株，選擇其中2 株產(chǎn)量超過5 000 mg/L 的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性。經(jīng)過5 代連續(xù)培養(yǎng)后，得到了1 株阿卡波糖產(chǎn)量穩(wěn)定的菌株UN-52，其阿卡波糖產(chǎn)量達(dá)到5 165.2 mg/L。出發(fā)菌株ZJB-08196 產(chǎn)量為4 518.7 mg/L，UN-52 與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了約12%。UN-52 傳代穩(wěn)定性結(jié)果如表4 所示。

表4 傳代穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Verification of the mutation strain UN-52

2.6 誘變菌株和出發(fā)菌株的發(fā)酵特性比較

為了比較突變株UN-52 與出發(fā)菌株發(fā)酵特性，監(jiān)測了2 株菌發(fā)酵過程中阿卡波糖、滲透壓、生物量和葡萄糖隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖6 所示。從圖中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長滲透壓和葡萄糖在逐漸降低，而阿卡波糖和生物量相應(yīng)地逐漸增加。而2 株菌的發(fā)酵曲線對比可以看出，突變株UN-52 發(fā)酵過程中滲透壓和葡萄糖下降得更快，而其生物量與阿卡波糖產(chǎn)量的增長則快于出發(fā)菌株。這說明突變株UN-52 相較于出發(fā)菌株來說，其對發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)利用得更快，所以其長勢更加旺盛，阿卡波糖產(chǎn)量也更高。

3 討論

原生質(zhì)體的制備和再生涉及到多種影響因素，要對各影響因素綜合考慮，才能獲得良好的制備與再生效果。甘氨酸對菌體的生長有明顯的抑制作用，先將菌體培養(yǎng)至生長旺盛的對數(shù)期，再轉(zhuǎn)接入含甘氨酸的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)則可以減輕抑制作用得到足夠的菌體。菌體的生理狀態(tài)對原生質(zhì)體制備和再生有一定影響，二級培養(yǎng)22 h 時(shí)菌體處于生長旺盛的對數(shù)期，菌體中大部分為新生菌絲，這樣更加有利于溶菌酶的酶解。在酶解過程中控制菌體的濃度也是十分必要的，菌體濃度過大，酶解體系粘度較大會影響原生質(zhì)體的釋放，菌體濃度過小，則細(xì)胞壁酶解過度難于再生。

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道過，再生培養(yǎng)基中添加膠體物質(zhì)，如明膠、聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂糖、藻酸鈣等，可以有效提高原生質(zhì)體的再生率［21］。一方面，這些膠體物質(zhì)可以穩(wěn)定原生質(zhì)體的生長環(huán)境以促進(jìn)再生。另一方面，膠體產(chǎn)生的膠體滲透壓可以防止環(huán)境中的水分滲透進(jìn)入原生質(zhì)體擾亂其生長［22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合操作方便性和經(jīng)濟(jì)因素，最后選擇添加0.2 g/L PVP，原生質(zhì)體的再生率達(dá)到15.14%。

圖6 ZJB-08196 和NU-52 發(fā)酵過程中阿卡波糖、滲透壓、生物量和葡萄糖的變化Fig.6 The course of acarbose，osmolality，biomass and glucose by ZJB-08196 and UN-52

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將Actinoplanes utahensisZJB-08196原生質(zhì)體通過紫外誘變的方法進(jìn)行誘變育種，獲得了1 株比出發(fā)菌株提高了12%的突變株UN-52，產(chǎn)量達(dá)到了5 165.2 mg/L。突變株UN-52 產(chǎn)阿卡波糖的能力高于已報(bào)道的馬妮［11］等人通過育種得到的菌株。通過發(fā)酵過程的比較表明，突變株UN-52 對營養(yǎng)物質(zhì)利用得更快，如果在發(fā)酵過程中補(bǔ)加營養(yǎng)物質(zhì)應(yīng)該能夠進(jìn)一步提高產(chǎn)量，下一步工作主要是突變株發(fā)酵條件優(yōu)化、補(bǔ)料策略的研究。

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