波紋巴非蛤蛋白分離及其性質(zhì)研究*

何小慶，曹文紅，趙子科，章超樺

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)

波紋巴非蛤(Paphia undulata)俗稱“花甲螺”、“花蚶”，系辯鰓綱簾蛤目簾蛤科，在我國(guó)廣泛分布于福建、廣東、廣西等沿海地區(qū)，福建省云霄縣東山灣是波紋巴非蛤主產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量近4 萬(wàn)t［1］。但以帶殼鮮銷為主，部分去殼取肉冷凍加工出口或加工成干制品、罐頭、蛤油，其利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益均不高，是一種尚未得到充分利用的海洋貝類資源。

研究表明波紋巴非蛤肉蛋白質(zhì)含量高，是良好的貝類蛋白質(zhì)資源［2］。關(guān)于水產(chǎn)尤其是貝類蛋白的分離與純化及性質(zhì)問(wèn)題，目前研究還較少［5－7］，而對(duì)波紋巴非蛤的研究主要集中于養(yǎng)殖［3］、凈化［4］等方面，對(duì)其蛋白組分及性質(zhì)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究參照日本學(xué)者Saito［8］的方法，將波紋巴非蛤蛋白分為肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、基質(zhì)蛋白，并對(duì)各蛋白組分的含氮量、分子量分布及其溶解性和濁度等進(jìn)行了測(cè)定和分析，旨在為波紋巴非蛤蛋白資源的深加工和綜合利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

新鮮的波紋巴非蛤開(kāi)殼取肉，去內(nèi)臟，用蒸餾水洗凈，分裝(每份約50g)，置于超低溫冰箱中。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

數(shù)顯pH 25C 酸度計(jì)，上?？祪x儀器有限公司;Sigma 3K3 高速冷凍離心機(jī)，貝朗國(guó)際生物工程公司;FA2104A 電子分析天平，上海天平儀器廠;T18 baisc 高速組織搗碎機(jī)，德國(guó)IKA 集團(tuán)公司;VULCAN.3 －550 PD. 馬福爐，美國(guó)VULCAN 公司;SB-5200 超聲波清洗機(jī)，海新芝生物技術(shù)研究所;UV-2102 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公公司;DYCZ-24EN 電泳槽，北京六一儀器廠;DYY-2C 電泳儀，北京六一儀器廠;Tanon GIS-2008 凝膠成像儀，上海天能科技有限公司，電泳蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Takara 大連寶生物工程有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

水分的測(cè)定:常壓干燥法(GB/T5009.3 －2010);粗蛋白的測(cè)定:微量凱氏定氮法(GB/T5009.3 －2003);灰分的測(cè)定:高溫灼燒法(GB/T5009.4 －2010);粗脂肪的測(cè)定:索氏提取法(GB/T5009.6 －2003);總糖含量的測(cè)定:蒽酮比色法。

1.3.2 蛋白質(zhì)分離方法

提取溫度除非特別說(shuō)明均為0 ～4℃。參照Saito等［8］的方法，將波紋巴非蛤肉分散于3 倍體積預(yù)冷的0.05 mol/L，pH7.0 的PBS 緩沖液中，高速組織勻漿機(jī)勻漿5min，4℃條件下浸提90 min(不時(shí)攪拌)，離心(10 000 r/min，15 min，4℃)，收集上清液，將沉淀分散于3 倍體積預(yù)冷的0.05 mol/L，pH7.0 的PBS 緩沖液中，重復(fù)上述操作，得上清液和沉淀S1。收集兩次離心后的上清液，按1∶1 的比例加入10%的TCA，離心(10 000 r/min，15 min，4℃)，上清液即非蛋白氮組分，沉淀S2 用丙酮漂洗3 次，除去TCA，然后揮發(fā)掉丙酮，用冰水溶解即得肌漿蛋白組分。將沉淀S1分散于3 倍體積的0.1 mol/L，pH 7.0，含1.0 mol/L NaCl 的磷酸鹽緩沖液中，高速組織勻漿機(jī)勻漿5 min，4℃下浸提18 h(不時(shí)攪拌)，離心(10 000 r/min，15min，4℃)，收集上清液，將沉淀分散于3 倍體積的0.1 mol/L，pH 7.0，含1.0 mol/L NaCl 的磷酸鹽緩沖液中，重復(fù)上述操作，收集兩次離心后的上清液，即為肌原纖維蛋白組分，所得沉淀部分即為基質(zhì)蛋白組分。肌原纖維蛋白透析脫鹽，可得脫鹽的肌原纖維蛋白。

1.3.3 蛋白組分含量測(cè)定

所有蛋白質(zhì)組分和非蛋白氮含量測(cè)定均采用微量凱氏定氮法。

1.3.4 蛋白質(zhì)分子量分布測(cè)定

采用5%濃縮，12%分離膠對(duì)分離后的波紋巴非蛤蛋白質(zhì)組分進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析?？捡R斯亮藍(lán)R-250 染色2 h，用脫色液(乙醇∶冰醋酸∶蒸餾∶水=25∶8∶67)脫色2 h。用Alphalmager HP 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 濁度測(cè)定

取一定量2 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)不同條件處理后，室溫(25℃)靜置20 min，測(cè)定吸光度(A340)。

1.3.6 溶解度測(cè)定

測(cè)定濁度后的蛋白溶液在4℃、5 000 r/min 下離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白溶解度。溶解度計(jì)算:

2 結(jié)果與討論

2.1 波紋巴非蛤基本營(yíng)養(yǎng)組成

波紋巴非蛤與其他貝類的基本營(yíng)養(yǎng)組成比較見(jiàn)表1。新鮮波紋巴非蛤肉含水量占82.07%，除水分之外含量最高的是粗蛋白，占原料12.33%，總糖占原料1.63%、粗脂肪占0.72%、灰分占0.83%。與關(guān)志強(qiáng)等［9］測(cè)得波紋巴非蛤粗蛋白含量(12.15%)相比，在誤差范圍之內(nèi)，這可能是由實(shí)驗(yàn)條件及不同季節(jié)波紋巴非蛤本身營(yíng)養(yǎng)組成存在差異所引起的誤差。以干基計(jì)，波紋巴非蛤粗蛋白含量占68.77%，均高于 同 屬 的 文 蛤 (51.53%)［10］、美 洲 簾 蛤(60.69%)［11］、菲律賓蛤仔(61.28%)［12］，與近江牡蠣、馬氏珠母貝相比，略低于馬氏珠母貝(74.9%)［13］，比 近 江 牡 蠣(50.63%)［14］高 出18.14%，粗脂肪含量均低于以上這5 種常見(jiàn)的雙殼貝。由此可知，波紋巴非蛤具有高蛋白低脂肪的特點(diǎn)，是一種值得重視的蛋白質(zhì)資源。

表1 波紋巴非蛤與其他貝類基本營(yíng)養(yǎng)組成比較 %Table 1 Nutrition composition of Paphia undulata compared with other shellfishes %

2.2 波紋巴非蛤蛋白質(zhì)組成

本文根據(jù)1.3.2 描述的方法對(duì)波紋巴非蛤肉蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，除非蛋白氮外，得到3 個(gè)蛋白質(zhì)組分:肌漿蛋白組分、肌原纖維蛋白組分和基質(zhì)蛋白組分，各蛋白質(zhì)組分占波紋巴非蛤肉總蛋白比例見(jiàn)圖1。

圖1 波紋巴非蛤肉蛋白質(zhì)組成Fig.1 Protein compositions of Paphia undulata

從圖1 可以看出，波紋巴非蛤肌原纖維蛋白組分占原料總蛋白比例最大，達(dá)45.42%，依次是肌漿蛋白(31.2%)、基質(zhì)蛋白(20.69%)、非蛋白氮含量占1.67%，非蛋白氮中主要成分為游離氨基酸、小肽及核苷酸等物質(zhì)，這可能與波紋巴非蛤味道鮮美有著極密切的關(guān)系。與其他水產(chǎn)動(dòng)物不同，貝類的軟體部分(可食部分)沒(méi)有骨骼組織，其組織與結(jié)構(gòu)主要由蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)組成，特別是肌原纖維蛋白和基質(zhì)蛋白。肌原纖維蛋白在肉的加工和貯存中起到非常重要的作用，不僅與肌肉收縮有關(guān)，還與肉制品的流變學(xué)特性如黏結(jié)性、保水性、彈性、質(zhì)地等有密切的關(guān)系，在糜類肉制品和重組肉制品的質(zhì)構(gòu)特性中起主要作用。因此，若將波紋巴非蛤肉添加到其他肉制品中，可以獲得具有貝類風(fēng)味肉制品新品種。

波紋巴非蛤在凍藏過(guò)程中易發(fā)生冷凍變性，這可能與其肌原纖維蛋白所占的比例有關(guān)。在貝肉蛋白質(zhì)變性中，肌原纖維蛋白變性比Ca2+-ATPase 活性變化幅度要大，說(shuō)明貝肉的肌球蛋白桿部比頭部更容易發(fā)生變性，這與對(duì)魚(yú)類的研究結(jié)論一致［15］。

2.3 波紋巴非蛤蛋白質(zhì)分子量分布

文本采用12%的分離膠，5%的濃縮膠對(duì)波紋巴非蛤各蛋白分離組分進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，用Alphalmager HP 凝膠成像系統(tǒng)拍照得到的電泳圖譜如圖2 所示。

圖2 蛋白質(zhì)組分SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE of protein components

SDS-PAGE 電泳分析圖譜顯示，3 種蛋白質(zhì)組分亞基分子量主要位于200 ～29.0 kDa;其中肌漿蛋白條帶較多、亞基分子量分布比較廣泛;肌原纖維蛋白組分分子量大多介于66.4 ～200 kDa 和29.0 ～38.0 kDa，200 kDa 處為肌球蛋白重鏈譜帶(MHC)，45 kDa附近處為肌動(dòng)蛋白譜帶，原肌球蛋白分布在35 kDa附近，小于20 kDa 為肌球蛋白輕鏈(MLC)，分布在100 kDa 附近的蛋白質(zhì)條帶則為副肌球蛋白，條帶顏色較深，說(shuō)明其所占比例較大。副肌球蛋白是無(wú)脊椎動(dòng)物特有的肌原纖維蛋白質(zhì)，與雙殼貝閉殼肌的特殊運(yùn)動(dòng)有關(guān)，在雙殼貝的閉殼肌中含量特別多，研究表明扇貝貝柱中副肌球蛋白占肌原纖維蛋白質(zhì)的50%以上［16］;基質(zhì)蛋白組分在190、97、44、29 kDa 有明顯的蛋白條帶。本次研究中，分離所得的基質(zhì)蛋白沒(méi)有作進(jìn)一步分離處理，所得基質(zhì)蛋白中含有少量的堿溶性蛋白組分，因此在低分子量范圍內(nèi)也出現(xiàn)了蛋白條帶。

2.4 溫度對(duì)肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

在室溫、pH7.0 下考察溫度對(duì)肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響?？疾鞙囟赛c(diǎn)為25、35、45、55、65、75 和85℃，當(dāng)溫度達(dá)到相應(yīng)值時(shí)立即取出試管于冰水中冷卻，測(cè)定濁度和溶解度。

圖3 溫度對(duì)肌漿蛋白、肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度的影響Fig.3 Effect of heating temperature on turbidity and solubility of myosinogen and myofibril protein solution

由圖3 可知:肌漿蛋白與肌原纖維蛋白受溫度的影響變化趨勢(shì)相似。在25 ～45℃時(shí)，肌漿蛋白與肌原纖維蛋白溶解度變化不顯著，說(shuō)明在此溫度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)未發(fā)生明顯變性，而濁度在此溫度范圍內(nèi)變化不明顯也可進(jìn)一步反映出蛋白質(zhì)變性情況;肌漿蛋白在55 ～65℃內(nèi)，肌原纖維蛋白在45 ～55℃變化區(qū)間內(nèi)溶解度均顯著降低(P＜0.05)，說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯的變性聚集，濁度在此溫度范圍內(nèi)顯著增大(P＜0.05)，這是由于加熱促使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)單體損失，疏水基團(tuán)暴露后發(fā)生聚集導(dǎo)致［17］;當(dāng)加熱溫度超過(guò)55℃，肌原纖維蛋白溶解度先緩慢下降后又逐漸上升，濁度緩慢增加，變化不顯著，當(dāng)加熱溫度超過(guò)65℃后，肌漿蛋白溶解度緩慢減小、濁度緩慢增大，變化都不顯著。此外，Paredi等［18］報(bào)道扇貝肌球蛋白的變性溫度為41.7 ～55.0℃。由此可以初步推測(cè)，波紋巴非蛤肌漿蛋白的熱變性溫度可能在55℃附近，肌原纖維蛋白的熱變性溫度可能在45℃附近。

2.5 pH 值對(duì)肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

在室溫(20 ～25℃)下考察pH 對(duì)肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度和溶解性的影響。取濃度為2 mg/mL 的蛋白溶液，用0.5 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液調(diào)pH 分別至3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 和9.5，緩慢攪拌30 min，測(cè)濁度，離心(4℃，5 000 g，15 min)，所得上清液用于測(cè)定蛋白質(zhì)溶解度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH 值對(duì)肌漿蛋白、肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度的影響Fig.4 Effect of pH on turbidity and solubility of myosinogen and myofibril protein solution

由圖4 可知:(1)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，肌漿蛋白的溶解性都較好，溶解度均大于71%，pH5.5 ～6.5 溶解性較低;在pH6.5 附近濁度達(dá)到最大，隨后隨pH 值增加而下降;(2)pH 對(duì)肌原纖維蛋白溶解度影響較大，在中性或堿性條件下肌原纖維蛋白的溶解性較好，在酸性條件下，肌原纖維蛋白的溶解性較差，當(dāng)pH ＜4.5 時(shí)，溶解度隨pH 值增大而降低，在pH4.5時(shí)降至最小，隨后顯著增大(P＜0.05);蛋白溶液濁度變化情況則相反。當(dāng)pH ＞6.5 時(shí)，溶解度和濁度增大或減少到一個(gè)穩(wěn)定范圍，變化不顯著。這與王耀耀等［19］對(duì)鮑魚(yú)腹足肌原纖維蛋白的溶解度和濁度研究所得變化趨勢(shì)有相似性。這可能是由于蛋白質(zhì)屬于兩性分子，當(dāng)環(huán)境pH 高于或低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷或正電荷，水分子同這些電荷相互作用并起穩(wěn)定作用，從而增加了蛋白質(zhì)的溶解性，對(duì)濁度的影響較小;當(dāng)pH 值接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子同水的作用較弱，使肽鍵能相互靠攏，有時(shí)能形成聚集體而導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀，從而使得溶解度降低，濁度升高。另外pH 對(duì)豬肉［20］、魚(yú)肉［21］的肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化有不同程度的影響，因此當(dāng)溶液的pH 從6.5 降低到4.5 時(shí)，肌原纖維蛋白所帶凈電荷和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致溶解度降低，濁度升高。

2.6 離子強(qiáng)度對(duì)肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

由于肌原纖維蛋白是用鹽溶液提取的，而肌漿蛋白是用離子強(qiáng)度很低的磷酸緩沖液提取的，故本次實(shí)驗(yàn)未考慮離子強(qiáng)度對(duì)肌漿蛋白濁度和溶解度的影響。

由圖5 可知，離子強(qiáng)度從0.2 mol/L 增大到0.6 mol/L 的過(guò)程中，波紋巴非蛤肌原纖維蛋白的濁度顯著下降(P＜0.05)，溶解度顯著升高(P＜0.05);當(dāng)離子強(qiáng)度大于0.6 mol/L 時(shí)，隨離子強(qiáng)度增加，濁度和溶解度變化不顯著。這可能是因?yàn)殡x子強(qiáng)度能夠改變氨基酸側(cè)鏈電荷分布，降低或增加蛋白質(zhì)之間的相互作用，改變肌原纖維蛋白的狀態(tài)，從而影響其理化性質(zhì)。肌原纖維蛋白不溶于水而溶于鹽溶液，在低離子強(qiáng)度下(＜0.4)形成均一的纖絲，所以濁度大而溶解度小，而在高離子強(qiáng)度下(＞0.4)形成分散的單體，處于可溶狀態(tài)，因此濁度小而溶解度大。

圖5 離子強(qiáng)度對(duì)肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度的影響Fig.5 Effect of ionic strength on turbidity and solubility of myosinogen and myofibril protein solution

3 結(jié)論

(1)新鮮波紋巴非蛤肉含水量為82.07%，粗蛋白12.33%，粗脂肪0.72%，灰分0.83%，總糖1.63%。對(duì)其蛋白組分分析結(jié)果表明，波紋巴非蛤蛋白中肌原纖維組分占原料粗蛋白的45.42%，肌漿蛋白蛋白組分占31.2%，基質(zhì)蛋白組分占20.69%，非蛋白氮占1.67%。

(2)波紋巴非蛤蛋白組分分子量分布范圍寬，但各組分之間又存在較大差異。肌漿蛋白組分亞基分子量分布比較廣泛，在200 ～29.0 kDa 之間;肌原纖維蛋白組分分子量大多介于66.4 ～200 kDa 和29.0～38.0 kDa 之間;基質(zhì)蛋白組分在190 kDa、97 kDa、44 kDa、29 kDa 有明顯的條帶。

(3)肌漿蛋白與肌原纖維蛋白濁度和溶解度受溫度影響的變化趨勢(shì)相似;pH 值對(duì)肌漿蛋白濁度和溶解度影響較小，對(duì)肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度影響較大;在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度下降，肌原纖維蛋白溶液的濁度上升，溶解度下降。

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