球形節(jié)桿菌C224 分批發(fā)酵2-酮基-D-葡萄糖酸的條件優(yōu)化及其動力學(xué)模型的構(gòu)建*

孫文敬，高培玲，魏轉(zhuǎn)，崔鳳杰，，周延政，滕文華，劉敬澤

1(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

2(河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊，050016)

3(百勤異VC 鈉有限公司，江西 上饒，334221)

4(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥工程系，河北 石家莊，050026)

2-酮 基-D-葡 萄 糖 酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)可以作為除莠化合物的生產(chǎn)原料，也可作為糠醛、D-阿拉伯糖、D-核糖、D-異抗壞血酸及其鹽類的合成前體，還是飼料添加劑、水泥增塑劑、洗滌劑的促凈劑和照片顯影劑的重要組分［1］，但其最主要的用途則是在食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鹽類的合成方面［2－3］。我國是目前國際上最大的D-異抗壞血酸(鹽)生產(chǎn)國，年產(chǎn)量接近40 000 t，占有該產(chǎn)品80%以上的國際市場份額。

相對于化學(xué)催化合成［4］、酶促合成［5－7］等其它生產(chǎn)方法，發(fā)酵法是目前最經(jīng)濟(jì)、最高效的2KGA 生產(chǎn)方法［1］，因而在工業(yè)生產(chǎn)中得到了普遍采用。國內(nèi)外2KGA 工業(yè)生產(chǎn)通常采用補(bǔ)料分批發(fā)酵模式，其發(fā)酵液中的產(chǎn)物濃度大、轉(zhuǎn)化率高，但生產(chǎn)強(qiáng)度較低，一般不會超過6.0 g/(L·h)，限制了設(shè)備利用率的提高與能源消耗的減少［2］。因此，對2KGA 發(fā)酵條件及發(fā)酵生產(chǎn)模式進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的。

有關(guān)2KGA 發(fā)酵條件的研究已有較多報道［8－10］，但幾乎未涉及國內(nèi)主要工業(yè)用菌之一的球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)，尤其是在通氣量與葡萄糖濃度對2KGA 發(fā)酵的影響方面。另外，發(fā)酵動力學(xué)的研究對發(fā)酵工藝的優(yōu)化和發(fā)酵生產(chǎn)模式的選擇具有具有重要的指導(dǎo)意義，但目前尚未見到有關(guān)球形節(jié)桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2KGA 動力學(xué)研究的報道。

在初步考察葡萄糖濃度與溶解氧對2KGA 發(fā)酵影響的基礎(chǔ)上，本研究試圖構(gòu)建能夠揭示球形節(jié)桿菌2KGA 分批發(fā)酵代謝基本特征的動力學(xué)模型，為發(fā)酵工藝和發(fā)酵生產(chǎn)模式的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

球形節(jié)桿菌C224，是以K1022 菌株為親株經(jīng)紫外誘變選育的2-酮基-D-葡萄糖酸高產(chǎn)菌株［11］，對噬菌體KS211、KS212、KS213 和KSL －1［12］具有穩(wěn)定的抗性。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0。

菌種擴(kuò)大培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0，玉米漿10.0，尿素2.0，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):大米淀粉水解糖(以無水葡萄糖計)162.0，玉米漿15.0，pH 6.7。大米淀粉水解糖由江西省德興市百勤異VC 鈉有限公司提供，其葡萄糖質(zhì)量濃度約為265.0 g/L，蛋白質(zhì)2.06 g/L(總氮 × 6.38)。

1.3 發(fā)酵裝置

鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司制造的GRJ-50D 全自動機(jī)械攪拌發(fā)酵系統(tǒng)，包括1 臺5L 的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)設(shè)備和1 臺50L 的自控不銹鋼發(fā)酵罐，該發(fā)酵系統(tǒng)具有自動控溫、無級調(diào)速、測定培養(yǎng)液溶解氧濃度和pH 值等功能。

1.4 培養(yǎng)條件

1.4.1 斜面菌種培養(yǎng)［2］

將活化的保藏菌種接種至斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.4.2 搖瓶種子培養(yǎng)［2］

將斜面菌種的菌懸液接入裝有50 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，30℃、260 r/min 旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)20 h。

1.4.3 種子擴(kuò)大培養(yǎng)

按2.0%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將搖瓶種子接入3.5 L 的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在罐溫30℃、罐壓0.03 MPa、通氣量105.0 L/h 和轉(zhuǎn)速400 r/min 的條件下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液中的菌體細(xì)胞濃度達(dá)到6.15 g/L 左右時，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.4.4 發(fā)酵

按10.0%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將液體種子接入35.0 L 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在罐溫32 ±2 ℃、罐壓0.03 MPa、通氣量52.5 L/min(發(fā)酵過程中最低溶解氧濃度不低于4.0%)、轉(zhuǎn)速450 r/min 的條件下進(jìn)行分批發(fā)酵。發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液的pH 值低于5.4 時，采用200.0 g/L 的Na2CO3溶液作為中和劑，維持發(fā)酵液的pH 值在5.6 ±0.2。

1.5 測定方法

1.5.1 種子培養(yǎng)液和發(fā)酵液中菌體細(xì)胞濃度的測定

采用比濁法測定［2］。25℃的條件下，用新制蒸餾水稀釋種子培養(yǎng)液或發(fā)酵液20 倍，以水作空白，用分光光度計測定其在650 nm 處的吸光度，并根據(jù)細(xì)胞干質(zhì)量與吸光度的線性關(guān)系求得菌體細(xì)胞濃度(每升發(fā)酵液中的細(xì)胞干質(zhì)量)。本實驗條件下，OD650nm=1 時細(xì)胞濃度為0.44 g/L。

1.5.2 發(fā)酵液中2KGA 的測定

采用高效液相色譜法測定［1］。

高效液相色譜儀的型號:1260 Infinity(美國Agilent 公司)。

色譜條件:色譜柱為Hypersil SAX 強(qiáng)陰離子交換色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為pH 3.0的0.1 mol/L KH2PO4溶液;流速為1.0 mL/min;檢測器為紫外檢測器;檢測波長為216 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量為50 μL。

1.5.3 葡萄糖的測定

采用SBA-40 型生物傳感分析儀測定［2］。

2 結(jié)果與分析

2.1 通氣量對球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 發(fā)酵的影響

工業(yè)生產(chǎn)條件下，通氣量與攪拌速率是影響發(fā)酵體系中溶解氧濃度的最主要的因素。根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗，無論是采用氣升式還是機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐，國內(nèi)2KGA 工業(yè)發(fā)酵過程中的最大通氣量為1.0 v·v－1·m－1，其糖酸轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到0.94 g/g(為理論產(chǎn)率的87.0%)以上，接近于實驗室發(fā)酵水平，一般認(rèn)為該通氣條件是合適的，忽視了通氣量對發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度的影響。2KGA 發(fā)酵是一個典型的生物氧化過程，維持細(xì)胞的生長代謝需要大量的氧氣，因此實驗設(shè)計通過增加通氣量來提高2KGA 的生產(chǎn)強(qiáng)度。研究結(jié)果(表1)表明，隨著通氣量的提高，細(xì)胞濃度明顯增加，發(fā)酵周期顯著縮短，生產(chǎn)強(qiáng)度大大增強(qiáng)，2KGA 的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率有所增加。當(dāng)通氣量超過1.5 v·v－1·m－1時，發(fā)酵過程中的最小溶解氧濃度明顯加大，但各項實驗指標(biāo)無顯著變化。因此，可以認(rèn)為本實驗條件下發(fā)酵的通氣量以不低于1.5 v·v－1·m－1為宜。

在通氣量為1.5 v·v－1·m－1的條件下，發(fā)酵過程中溶解氧的變化如圖1 所示。從圖中可以看出，發(fā)酵的前3 h，發(fā)酵液中的溶解氧濃度迅速降低;至4 h時，溶解氧濃度達(dá)到最低，只有4.0%左右;4 ～20 h之間，溶解氧濃度緩慢增加，至20 h 時達(dá)到20.0%左右;20 h 后，溶解氧濃度迅速回升，發(fā)酵接近終點(24 h)時溶解氧濃度達(dá)到73.0%以上。

表1 通氣量對球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 發(fā)酵的影響Table 1 Effect of aeration rate on the 2KGA fermentation performance by Ar. globiformis C224

圖1 球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 發(fā)酵過程中溶解氧濃度的變化Fig.1 Profile of dissolved oxygen during 2KGA production by Ar. globiformis C224

2.2 葡萄糖濃度對球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 發(fā)酵的影響

在2KGA 發(fā)酵過程中，碳氮比偏大或偏小均不利于菌體產(chǎn)酸［8］。因此，本實驗保持大米淀粉水解糖與玉米漿的比例不變，通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，考察其對球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 發(fā)酵的影響。研究結(jié)果(表2)表明，葡萄糖濃度低于150.0 g/L 時，隨著葡萄糖濃度的提高，發(fā)酵液中的最大細(xì)胞濃度、生產(chǎn)強(qiáng)度、2KGA 產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率逐步增大，發(fā)酵周期逐步延長;葡萄糖濃度在120.0～180.0 g/L 時，發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度和糖酸轉(zhuǎn)化率基本穩(wěn)定，分別保持在6.36 g/(L·h)和0.96 g/g(約為理論產(chǎn)率的88.75%)以上;葡萄糖濃度達(dá)到210.0 g/L時，發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度和糖酸轉(zhuǎn)化率分別只有5.41 g/(L·h)和0.87 g/g。因此，球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖濃度以120.0 ～180.0 g/L 為宜。

表2 葡萄糖濃度對球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 發(fā)酵的影響Table 2 Effect of initial glucose concentration on the 2KGA fermentation performance by Ar. globiformis C224

2.3 球形節(jié)桿菌C224 菌株的2KGA 發(fā)酵過程

在初始葡萄糖濃度為162.0 g/L、通氣量為1.5 v·v－1·m－1的條件下進(jìn)行發(fā)酵。定時取樣測定發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度、葡萄糖濃度和發(fā)酵產(chǎn)物2KGA 的濃度，并計算細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度、葡萄糖消耗速率和發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度，繪制球形節(jié)桿菌C224 菌株的2KGA 發(fā)酵過程曲線(圖2)。

從圖2 可以看出，球形節(jié)桿菌C224 菌體細(xì)胞的生長幾乎沒有延滯期，很快進(jìn)入對數(shù)生長期(0 ～2 h的細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度約為0.22 g/(L·h)，4 h 時細(xì)胞濃度就已達(dá)到2.51 g/L 左右，發(fā)酵2 ～4 h 的細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度最高［約為0.64 g/(L·h)］;4 ～16 h，細(xì)胞濃度的增幅急劇減緩，其生產(chǎn)強(qiáng)度只有0.06 g/(L·h)左右;16 h 后，細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期并持續(xù)至發(fā)酵達(dá)到終點。從圖2 還可看出，葡萄糖消耗與2KGA 積累的變化趨勢一致。在細(xì)胞生長的對數(shù)期內(nèi)，盡管葡萄糖的消耗速率和2KGA 生產(chǎn)強(qiáng)度相對較低，但仍然分別達(dá)到4.00 g/(L·h)和2.71 g/(L·h)(發(fā)酵2 h);8～16 h 是2KGA 的高速合成期，葡萄糖的消耗速率達(dá)到7.10 g/(L·h)左右，2KGA 的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到7.50 g/(L·h)左右，幾乎所有被消耗的葡萄糖按理論產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為2KGA;16 h 后，葡萄糖消耗速率與2KGA生產(chǎn)強(qiáng)度明顯降低。

根據(jù)上述研究結(jié)果，可以將球形節(jié)桿菌C224 的2KGA 發(fā)酵過程分為2 個階段:第1 階段，菌體處于對數(shù)生長期，同時將所消耗的葡萄糖部分轉(zhuǎn)化為2KGA;第2 階段，菌體生長處于穩(wěn)定期，2KGA 持續(xù)高速合成至葡萄糖消耗殆盡，所消耗的葡萄糖幾乎被完全轉(zhuǎn)化為2KGA，由此可以初步推定球形節(jié)桿菌C224 生產(chǎn)2KGA 的發(fā)酵過程為部分生長聯(lián)系型。

圖2 球形節(jié)桿菌C224 菌株分批發(fā)酵生產(chǎn)2KGA 的過程Fig. 2 Time course of 2KGA batch fermentation by Ar. globiformis C224

2.4 球形節(jié)桿菌C224 菌株分批發(fā)酵生產(chǎn)2KGA 動力學(xué)模型的構(gòu)建

2.4.1 菌體生長動力學(xué)模型

能夠描述菌體生長動力學(xué)的模型很多，但以Monod 和Logistic 方程最為常用［13］。從圖2 可以發(fā)現(xiàn)，4 h 時菌體細(xì)胞濃度就已達(dá)到發(fā)酵過程中最高細(xì)胞濃度的75%以上，隨后細(xì)胞生長趨緩，在發(fā)酵后期細(xì)胞濃度達(dá)到最大值。因此，以Logistic 方程［14］來描述球形節(jié)桿菌C224 的生長規(guī)律較為合適，即:

當(dāng)t=0 時，X=X0，對式(1)進(jìn)行積分可得代數(shù)方程(2):

將圖2 的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用于上述模型，利用Origin 8.0 對菌體生長動力學(xué)模型參數(shù)進(jìn)行求解，結(jié)果為:X0=0.70 g/L;Xm=3.16 g/L;μm=0.54 h－1。對菌體生長的實驗數(shù)據(jù)與模型計算值進(jìn)行比較，其平均相對偏差計算為5.27 %(圖3)。

圖3 菌體生長實驗值和模型計算值的比較Fig.3 Comparison between experimental data and predictive values of cell growth model

從非線性擬合出的生長曲線中可以看出，菌體生長幾乎沒有延滯期，細(xì)胞濃度的增幅隨發(fā)酵時間的推移逐漸減緩，且在發(fā)酵的中后期細(xì)胞濃度達(dá)到最大值。另外，從圖3 中還可以看出，模型計算值和實驗值擬合效果良好，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.951 4，說明所選擇的模型能夠較好地反映球形節(jié)桿菌C224 的生長規(guī)律。

2.4.2 產(chǎn)物形成動力學(xué)模型

根據(jù)發(fā)酵過程中產(chǎn)物形成與底物利用之間的關(guān)系，發(fā)酵產(chǎn)物形成的過程可被分為3 類:生長聯(lián)系型(簡單發(fā)酵型)、部分生長聯(lián)系型(中間發(fā)酵型)和非生長聯(lián)系型(復(fù)雜發(fā)酵型)［15］。

利用經(jīng)典的Luedeking-Piret 方程［16］描述產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為:

當(dāng)a≠0，b=0 時，產(chǎn)物形成為生長聯(lián)系型;當(dāng)a=0，b≠0 時，產(chǎn)物形成為非生長聯(lián)系型;當(dāng)a≠0，b≠0 時，產(chǎn)物形成為部分生長聯(lián)系型;

將式(1)代入式(3)，得:

積分后得:

其中

將μm、X0、Xm和圖2 的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用于上述模型，利用Origin 8.0 對產(chǎn)物合成動力學(xué)模型參數(shù)進(jìn)行求解，結(jié)果為:a=3.62;b=2.29。計算結(jié)果表明，球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 的合成屬于部分生長聯(lián)系型。對2KGA 合成的實驗數(shù)據(jù)與模型計算值進(jìn)行比較，其平均相對偏差計算為5.73%(圖4)。

圖4 2KGA 產(chǎn)量實驗值和模型計算值的比較Fig.4 Comparison between experimental data and predictive values of 2KGA production model

從圖4 中可以看出，實驗數(shù)據(jù)與模型計算值模型的擬合效果很好，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.995 4，說明所選擇的模型能夠比較準(zhǔn)確地反映球形節(jié)桿菌C224菌株2KGA 的合成規(guī)律。

2.4.3 底物消耗動力學(xué)模型

常見的底物消耗動力學(xué)模型是基于底物消耗的物料衡算而建立的方程式。在發(fā)酵過程中，底物一部分消耗用于菌體的生長和維持細(xì)胞生命活動，一部分用于形成產(chǎn)物［13］。因此，底物消耗速率可表示如下:

將式(1)和式(3)帶入，積分得

將μm、X0、Xm和圖2 的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用于上述模型，利用Origin 8.0 對底物消耗動力學(xué)模型參數(shù)進(jìn)行求解，結(jié)果為:c=6.34;d=2.01;Yx/s=0.340 5 g/g;Yp/s=1.062 6 g/g。對葡萄糖消耗的實驗數(shù)據(jù)與模型計算值進(jìn)行比較，其平均相對偏差計算為4.34%，結(jié)果如圖5 所示。從圖中可以看出，實驗數(shù)據(jù)和模型計算值擬合效果很好，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.994 7，說明所選擇的模型能夠比較準(zhǔn)確地反映了葡萄糖的消耗規(guī)律。

3 結(jié)論

圖5 殘?zhí)菍嶒炛岛湍Ｐ陀嬎阒档谋容^Fig.5 Comparison between experimental data and predictive values of glucose consumption model

通氣量和葡萄糖濃度對球形節(jié)桿菌C224 菌株2KGA 發(fā)酵均有明顯影響，通氣量以不低于1.5 v·v－1·m－1為宜，葡萄糖濃度以120.0 ～180.0 g/L 為宜。在適宜的發(fā)酵條件下，球形節(jié)桿菌C224 菌株分批發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)6.36 g/(L·h)以上，糖酸轉(zhuǎn)化率不低于0.96 g/g(約為理論產(chǎn)率的88.75%)。

構(gòu)建的發(fā)酵動力學(xué)模型能夠比較準(zhǔn)確地反映球形節(jié)桿菌C224 菌體生長、2KGA 合成與葡萄糖消耗的規(guī)律，有助于進(jìn)一步了解該發(fā)酵菌種的生理特性和特征、菌種生長和目的產(chǎn)物積累的適宜條件以及各種發(fā)酵參數(shù)之間的關(guān)系，對發(fā)酵工藝優(yōu)化、過程控制及設(shè)備放大具有具有重要的指導(dǎo)意義。

符號說明

X—菌體濃度( g/L) ;t—發(fā)酵時間( h) ;X0—起始菌體濃度( g/L) ;Xm—最大菌體濃度( g/L) ; μm—最大比生長速率( h－1) ;S—葡萄糖濃度( g/L) ;S0—起始葡萄糖濃度( g/L) ;a，

b—與菌體生長量相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù);ms—細(xì)胞維持系數(shù)［g/( g·s) ］;P—2KGA 濃度( g/L) ;Yx/s—菌體對葡萄糖的得率系數(shù)( g/g) ;Yp/s—2KGA 對葡萄糖的得率系數(shù)( g/g) 。

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