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    結(jié)締組織生長因子基因RNA干擾復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

    2013-10-29 09:37:00郝春秋彭梅娟謝玉梅周云魏欣馬力王素娜李瑞娟張巖白雪帆賈戰(zhàn)生
    生物技術(shù)通訊 2013年1期
    關(guān)鍵詞:寡核苷酸腺病毒質(zhì)粒

    郝春秋,彭梅娟,謝玉梅,周云,魏欣,馬力,王素娜,李瑞娟,張巖,白雪帆,賈戰(zhàn)生

    第四軍醫(yī)大學(xué) 唐都醫(yī)院感染病診療中心,陜西 西安 710038

    腺病毒具有宿主范圍廣、感染率高、包裝容量大、繁殖滴度高、安全性好、性質(zhì)穩(wěn)定、載體制備較容易等特點(diǎn)[1],已成為應(yīng)用最廣泛的載體系統(tǒng)之一。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是重要的促組織纖維化蛋白,與肝、肺、腎等許多器官的纖維化密切相關(guān)[2],是促進(jìn)膠原沉積致肝纖維化的主要細(xì)胞因子。RNA干擾(RNA interfer?ence,RNAi)可以在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因表達(dá),使靶基因沉默,是研究特定基因功能的可靠技術(shù)[3]。我們試圖利用RNAi原理,構(gòu)建能介導(dǎo)CTGF基因沉默的復(fù)制缺陷型腺病毒載體,為肝纖維化的防治提供一個有用的工具。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    腺病毒載體系統(tǒng)(穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1、骨架質(zhì)粒pAdEasy-1及包裝細(xì)胞AD-293)由德國學(xué)者Reske教授惠贈;大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自ATCC;大腸桿菌BJ-5183和DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR產(chǎn)物回收試劑盒及Plasmid Purifica?tion Kit均為Promega公司產(chǎn)品;脂質(zhì)體Lipo?fectAMINE2000、DMEM、RPMI1640及胎牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品;抗CTGF單克隆抗體、抗β-actin抗體購自Abcam公司;山羊抗鼠IgG-HRP抗體購自Santa Cruz公司。

    1.2 靶向CTGF短發(fā)夾RNA的設(shè)計(jì)

    根據(jù)小干擾 RNA(siRNA)設(shè)計(jì)原則[4-5],參考GenBank公布的大鼠 CTGF(NM-022266)核苷酸序列,利用Ambion公司在線(http://www.ambion.com)設(shè)計(jì)工具,設(shè)計(jì)4對針對CTGF基因的siRNA序列(TS1~TS4)和1對無關(guān)陰性對照序列(TS5),并進(jìn)行BLAST同源性分析,保證序列的惟一性。為方便克隆與鑒定,在其5'和3'端分別引入BglⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn),反義片段以后接終止信號TTTTTT以終止轉(zhuǎn)錄,形成BglⅡ酶切位點(diǎn)+19nt正義靶序列+9nt loop接頭序列+19nt反義靶序列+終止信號+HindⅢ酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)(寡核苷酸由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成)。見表1。

    1.3 腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF的構(gòu)建及鑒定

    將合成的單鏈寡核苷酸退火形成雙鏈DNA并檢測無誤。用HindⅢ、BglⅡ雙酶切穿梭質(zhì)粒pShut?tle-H1(圖1),酶切產(chǎn)物純化后,用T4噬菌體DNA連接酶于16℃連接線性化的pShuttle-H1及退火后的雙鏈DNA 12 h,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌,在卡那霉素抗性LB平板上于37℃培養(yǎng)過夜,篩選擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的陽性菌落,提取質(zhì)粒并純化后獲得腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF,用EcoRⅠ酶切鑒定,并將酶切后獲得的小片段回收進(jìn)行測序分析。

    1.4 復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad.H1-CTGF的包裝和滴定

    培養(yǎng)腺病毒包裝細(xì)胞AD-293,達(dá)80%~90%匯合時加入1 μg鑒定無誤的腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shut?tle-CTGF 與 4 μg 骨 架 質(zhì) 粒 pAdEasy-1,用 Lipo?fectAMINE2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,使之進(jìn)行同源重組,第2 d傳代;轉(zhuǎn)染7~10 d后,75%~80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時收集細(xì)胞,-80℃和37℃反復(fù)凍融3次釋毒,離心凍融液收集上清,即為第一代腺病毒載體Ad.H1-CTGF毒種,作為隨后大量病毒擴(kuò)增的原液,3次擴(kuò)增后獲得病毒保存液。同法獲得無關(guān)陰性對照病毒Ad.H1-Con原液及保存液,均于-80℃保存。病毒滴定采用TCID50法,即將病毒原液梯度稀釋至1/10-6~1/10-12,分別接種生長于96孔培養(yǎng)皿中的AD-293細(xì)胞,37℃培養(yǎng)72 h,用X-gal染色,計(jì)算病毒滴度。

    1.5 空斑實(shí)驗(yàn)檢測腺病毒載體的感染性

    將肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞低密度鋪于6孔板中,培養(yǎng)1 d后達(dá)60%~70%融合,用感染復(fù)數(shù)(MOI)為100的腺病毒載體Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染細(xì)胞,未感染病毒的細(xì)胞為對照,加甲基纖維素覆蓋液后37℃培養(yǎng)7 d,吸除覆蓋液加結(jié)晶紫染色,清洗后觀察空斑形成情況。

    1.6 Western印跡檢測病毒載體對CTGF基因的沉默效果

    圖1 腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1圖譜及構(gòu)建示意圖

    表1 編碼siRNA的DNA雙鏈

    HSC-T6細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)1 d達(dá)60%~70%融合后,用MOI為100的腺病毒載體Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染細(xì)胞,37℃培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞、提取蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE,然后將蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,以抗CTGF單克隆抗體為一抗(1∶10)、山羊抗鼠IgG-HRP抗體為二抗(1∶100)進(jìn)行 Western印跡,檢測腺病毒載體對CTGF基因的沉默效果。

    2 結(jié)果

    2.1 含靶序列的單鏈寡核苷酸退火產(chǎn)物檢測

    將合成的4對含靶序列、1對陰性對照序列的單鏈寡核苷酸于90℃溫育4 min、70℃溫育10 min,緩慢冷卻至室溫進(jìn)行退火,用12%非變性PAGE檢測退火形成雙鏈DNA的效率,均達(dá)90%以上(圖2),提示退火產(chǎn)物合格,可用來構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒。

    2.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF的鑒定

    由腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1圖譜(圖1)可看出,MCS中含有2個EcoRⅠ酶切位點(diǎn),EcoRⅠ酶切后形成2個片段,大片段6600 bp,小片段為300 bp的H1啟動子序列。在BglⅡ和HindⅢ位點(diǎn)間插入合成的寡核苷酸靶序列后,小片段長度則變?yōu)?60 bp。電泳結(jié)果(圖3)顯示,陰性對照質(zhì)粒p-shut?tle-H1酶切小片段為300 bp,陽性克隆質(zhì)粒p-shut?tle-CTGF酶切小片段為360 bp,大片段均為6600 bp,初步證明重組腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。回收360 bp小片段進(jìn)行測序,證實(shí)序列完全正確(基因序列略)。

    圖2 退火產(chǎn)物電泳圖譜

    圖3 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF的酶切鑒定

    2.3 腺病毒載體的滴定和感染性鑒定

    采用TCID50法對病毒進(jìn)行滴定,測出病毒保存液滴度為4×1010PFU/mL。用MOI為100的目標(biāo)病毒Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染HSC-T6細(xì)胞,7 d后目標(biāo)病毒Ad.H1-CTGF組和陰性對照病毒組Ad.H1-Con均有大量空斑形成,未感染病毒的HSC-T6細(xì)胞未見空斑形成,說明構(gòu)建的目標(biāo)病毒和陰性無關(guān)對照病毒均具有較好的感染性(圖4)。

    2.4 腺病毒載體對CTGF基因沉默效果的Western印跡鑒定

    Western印跡檢測發(fā)現(xiàn),內(nèi)參照蛋白β-actin的表達(dá)水平在6組之間無明顯差異;而CTGF蛋白表達(dá)在包裝的4組目標(biāo)病毒感染HSC-T6細(xì)胞后均有不同程度降低,其中含靶序列TS3的病毒感染組降低最顯著;無關(guān)序列陰性對照病毒感染組CTGF蛋白表達(dá)與未感染細(xì)胞組一樣,未見降低(圖5)。提示構(gòu)建的含TS3靶序列的腺病毒載體具有較好的沉默CTGF基因的效果,將其命名為Ad.H1-CTGF,可作為以后抗纖維化研究的工具。

    3 討論

    我國是肝病大國,隨著慢性肝病病程的延續(xù),其纖維化的進(jìn)程也一直持續(xù),由于目前缺乏行之有效的根治辦法,這些人都面臨著肝硬化的潛在威脅,這已成了嚴(yán)峻的社會問題。因此,尋找有效的抗纖維化方法,阻止慢性肝病患者的肝硬化趨勢,已成為我國乃至全球亟待解決的問題。

    圖4 包裝的腺病毒感染滴定

    圖5 各組病毒對CTGF表達(dá)的影響

    肝纖維化的成因,普遍認(rèn)為與肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化有關(guān)[6],轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是目前公認(rèn)的致纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一,其促纖維化作用主要是通過誘導(dǎo)其下游因子CTGF的表達(dá),活化HSC來完成。業(yè)已證明,CTGF與肝、肺、腎等器官的纖維化、皮膚瘢痕形成、創(chuàng)傷修復(fù)及動脈粥樣硬化密切相關(guān)[7]。由于CTGF的生物學(xué)效應(yīng)相對單一,主要介導(dǎo)TGF-β的促細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成等作用,因此,阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性,可能是一種更特異、更有效的防止肝纖維化的手段。

    RNAi技術(shù)具有高效性和高特異性,作為關(guān)閉基因的新技術(shù),已被廣泛應(yīng)用[8]。RNAi的產(chǎn)生需要向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入siRNA或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA,前者是將體外合成的siRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞,雖簡單,但導(dǎo)入的siRNA易降解,且以瞬時表達(dá)為主,目前已較少使用;后者通過表達(dá)siRNA的質(zhì)?;虿《据d體在靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA,發(fā)揮RNAi作用,因方便、穩(wěn)定和高效而成為主流方法。腺病毒載體可以直接、高效、穩(wěn)定地感染細(xì)胞,避免了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的不便,逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9-13]。

    我們根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則[4-5],設(shè)計(jì)了4對針對CTGF基因的siRNA序列和1對無關(guān)陰性對照序列,退火形成雙鏈DNA后定向克隆至pShuttle-H1的H1啟動子下游,獲得腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF1-5,經(jīng)酶切、測序鑒定無誤后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞,同源重組后獲得4株腺病毒載體和1株陰性對照病毒,空斑實(shí)驗(yàn)證實(shí)它們均具有較好的感染性,Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)4組目標(biāo)病毒對HSC-T6細(xì)胞CTGF的表達(dá)均有不同程度的抑制,其中Ad.H1-CTGF3的抑制效果最好,抑制率達(dá)85%,達(dá)到了設(shè)計(jì)要求。該腺病毒載體的構(gòu)建成功,將為抗纖維化的研究提供可行的工具,為肝纖維化和肝硬化的防治奠定基礎(chǔ)。

    [1]Caruso M,Khiem P N,Kwong Y L,et al.Adenovirus-mediat?ed interleukin-12 gene therapy for metastatic colon carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:11302-11306.

    [2]Ito Y,Goldschmeding R,Bende R,et al.Kinetics of connec?tive tissue growth factor expression during experimental prolif?erative glomerulonephritis[J].J Am Soc Nephrol,2002,12:472-484.

    [3]Hannon G L.RNA inteference[J].Nature,2002,418:244-251.

    [4]Tuschl T.Expanding small RNA interference[J].Nat Biotech?nol,2002,20(5):446-448.

    [5]Reynolds A,Leake D,Boese Q,et al.Rathonal siRNA de?sign for RNA interference[J].Nat Biotechnol,2004,22(3):326-330.

    [6]Bedosa P,Paradis V.Approaches foe treatment of liver fibro?sis in chronic hepatitis C[J].Lin Liver Dis,2003,7:195-210.

    [7]Paradis V,Dargere D,Bonvoust F,et al.Effect and regula?tion of connective tissue growth factor on hepatic stellate cells[J].Lab Invest,2002,82:767-774.

    [8]Elbashir S M,Lendeckel W,Tuschl T,et al.Duplexes of 21-nucleotideRNAsmediateRNA interferencein cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411:428-429.

    [9]Sumimoto H,Yamagata S,Shimizu A,et al.Gene therapy for human small-celllungcarcinomabyinactivation ofSkp-2 with virally mediated RNA interference[J].Gene Thera,2005,12:95-100.

    [10]Xia H,Mao Q,Paulson H L,et al.siRNA-mediated gene si?lencing in vitro and in vivo[J].Nat Biotechnol,2002,20:1006-1010.

    [11]Shen C,Buck A K,Liu X,et al.Gene silencing by adenovi?rus-delivered siRNA[J].FEBS Lett,2003,539:111-114.

    [12]Zhao Ling-Jun,Jian Heng,Zhu Henghu.Specific gene inhibi?tion by adenovirus-mediated expression ofsmallinterfering RNA[J].Gene,2003,316:137-141.

    [13]Kewal K J.RNAi and siRNA in target validation[J].Drug Dis?covery Today,2004,9:307-309.

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