重組SCIRR39多克隆抗體的制備及檢測

倪艷麗，李欣，劉少君

軍事醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室，北京 100850

脊髓損傷與修復反應(yīng)受多種因素影響，是有多種分子參與的復雜的病理過程，目前其分子機理仍不明確，因而無法找到有效干預措施。脊髓損傷與修復蛋白39（spinal cord injury and regeneration re?lated protein 39，SCIRR39）基因是我們克隆到的在大鼠脊髓損傷及修復過程中上調(diào)表達的基因[1]，是大鼠核糖核酸酶抑制因子基因的突變體[2-4]，其編碼的蛋白以前只發(fā)現(xiàn)存在于胞漿內(nèi)，而近年有報道顯示該蛋白還存在于細胞核及線粒體中[5]，但功能不詳。為進一步研究該蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其他組織中的分布，及其在脊髓損傷修復過程中可能的作用，我們制備了針對該蛋白的特異性抗體，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與修復機理研究提供有效的臨床干預線索。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性成年日本大耳白兔（體質(zhì)量2.5 kg）購自軍事醫(yī)學科學院動物中心；大腸桿菌BL21（DE3）由本室保存；克隆載體pGEM-T/T easy、瓊脂糖、質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；EcoRⅠ、BamHⅠ等常用限制性內(nèi)切酶，DL2000 DNA marker，T4DNA連接酶，LA Taq、Pyrobest DNA 聚合酶，IPTG，X-gal，dNTP均購自TaKaRa公司；Super ScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 PCR擴增Scirr39基因

從大鼠全橫斷損傷脊髓提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板擴增Scirr39基因片段。兩端引物分 別 為 39-ORF-5'（ATGTCTCTGGACATCCAGTC）和 39-ORF-3'（TCAGGAGATGACCCTCAGGGATG GC）。PCR 條件：94℃ 2 min，然后以 94℃ 20 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min 進 行 30 個 循 環(huán) ，72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收后，T-A克隆入pGEM-T easy載體中，將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以EcoRⅠ酶切鑒定重組克隆后進一步測序鑒定，保存含有正確重組載體的菌種。

1.3 pGEX-GST-SCIRR39-C融合表達載體的構(gòu)建

以構(gòu)建的Scirr39 ORF載體為模板PCR擴增SCIRR39-C端抗原表位編碼DNA序列，引物分別為E39-N（CGTGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCG GCGGCGGCAGCGCGGAACTGTGCCAGGGCCCG）和E39-C（CGGGAATTCTCAGCTAATCACGCGCAGGC TCGGTTTATCT），兩端分別引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點（下劃線序列）及保護堿基，并在上游引物的5'端引入10個甘氨酸接頭。PCR條件：94℃ 5 min，然后以 94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min 進行25個循環(huán)，72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收后，BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切回收目的片段，與經(jīng)相同酶消化的表達載體pGEX-4T-2連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得表達載體 pGEX-GST-SCIRR39-C，經(jīng) BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切和測序驗證，表明目的基因已插入pGEX-4T-2。

1.4 GST-SCIRR39-C融合蛋白的原核表達和純化

把pGEX-GST-SCIRR39-C轉(zhuǎn)化表達菌株BL21（DE3），陽性克隆用LB培養(yǎng)基于37℃振搖過夜，取100 μL菌液加入10 mL氨芐西林抗性的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，D600nm達0.6～0.8時加入0.2 mmol/L IPTG誘導12～16 h，收集菌體，PBS洗3次，超聲波破碎，收集上清，用預裝谷胱甘肽瓊脂糖凝膠的GST rap FF柱親和純化，再用還原性谷胱甘肽洗脫GST-SCIRR39-C融合蛋白，所有純化操作均在GE Health公司?KTA Prime蛋白純化系統(tǒng)上進行，最后用SDS-PAGE鑒定融合蛋白的純化結(jié)果。

1.5 SCIRR39-C抗原表位蛋白的分離

用1 mL注射器，將80 μL凝血酶與920 μL 1×PBS的混合液注入GST rap柱，封閉柱兩端，23～24℃放置16 h；采用1 mL注射器，用3 mL 1×PBS以1 mL/min的流速洗下柱中解離下來的SCIRR39-C蛋白（懸于冰上操作），隨后用10 mL洗脫緩沖液以1 mL/min的流速洗脫柱中的GST蛋白（懸于冰上操作），以評價凝血酶酶切效率。純化后的SCIRR39-C蛋白經(jīng)冷凍干燥濃縮，以備檢測抗體效價時使用。

1.6 抗體制備

取飼養(yǎng)1周、體質(zhì)量為2.5 kg的純種日本大耳白兔，免疫前從耳緣靜脈取正常血清作為對照。將1 mg抗原與等體積弗氏完全佐劑混合直到形成乳濁液，采用背部多點皮下注射；2周后，取1 mg抗原與等體積弗氏不完全佐劑充分混勻，背部多點注射進行二次加強免疫；免疫后7～10 d從耳緣靜脈取血，ELISA測定抗體效價，若滴度小于1∶1000，進一步加強免疫，要求每2周免疫一次，直到抗體效價達到所需滴度；到所需滴度后的第10 d從頸動脈采血，采集的血液室溫斜置30 min，移到4℃冰箱待血清析出，收集血清后1000 r/min離心10 min，0.5 mL/支分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 ELISA測定抗體滴度

用pH9.6的包被緩沖液將免疫所用蛋白稀釋至所需濃度（100 ng/100 μL），在酶標板每孔中加入100 μL，并將板置于濕盒中，4℃過夜或37℃保溫4 h；用PBS-T洗板3次后每孔加入200 μL封閉液，于37℃保溫1 h，隨后用PBS-T洗板3次；一抗用生理鹽水進行 1/10 梯度稀釋，100 μL/孔，4℃過夜，用PBS-T洗板3次，接著進行二抗反應(yīng)，37℃保溫2 h，用PBS-T洗板3次；進行顯色反應(yīng)，用BIO-RAD 680酶標儀測定D492nm值。

1.8 Western印跡檢測抗體特異性

取SCIRR39-C重組抗原表位蛋白進行SDSPAGE，采用預染蛋白標準以便于檢測轉(zhuǎn)移效率。15 V以下恒壓轉(zhuǎn)移45 min，于1%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入制備的一抗Anti-SCIRR39（1∶500）室溫孵育1 h，用0.1%PBST洗3次，各10 min；以封閉液稀釋HRP標記的二抗（1∶2000），與硝酸纖維素膜一起于室溫共孵育1 h；用0.1%PBST洗3次，各10 min；ECL試劑顯色。

2 結(jié)果

2.1 Scirr39基因的克隆及鑒定

以大鼠全橫斷損傷脊髓的總RNA為模板，加入上下游引物，PCR擴增得到特異目的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明擴增片段長1386 bp（圖1）。

2.2 GST-SCIRR39-C融合表達載體的構(gòu)建

為了免疫動物制備抗體，我們將Scirr39編碼區(qū)C端的1077～1383 bp（圖2）克隆到pGEX-4T-2原核表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑選陽性克隆，經(jīng)過測序保證其序列正確。

2.3 GST-SCIRR39-C融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達

在30℃、0.2 mmol/L IPTG誘導條件下表達GST-SCIRR39-C融合蛋白。GST相對分子質(zhì)量（Mr）為 26×103，SCIRR39-C為 11.9×103，融合蛋白為37.9×103。圖3顯示表達的融合蛋白Mr與理論值一致。

圖1 Scirr39基因編碼區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物

圖2 SCIRR39-C端抗原表位編碼DNA片段的擴增

圖3 SDS-PAGE檢測GST-SCIRR39-C的表達

2.4 融合蛋白的純化

在GE Health公司?KTA Prime蛋白純化系統(tǒng)上進行，圖4為SDS-PAGE檢驗純化結(jié)果。

2.5 融合蛋白的酶切

GST-SCIRR39-C融和蛋白經(jīng)凝血酶消化后，SCIRR39-C蛋白流出液及GST洗脫液如圖5所示，主要蛋白條帶Mr分別約為 26×103和11.9×103。

2.6 抗SCIRR39蛋白兔抗血清的ELISA效價測定

干燥后的融合蛋白溶于0.1 mol/L PBS，終濃度1 mg/mL，采用背部多點皮內(nèi)注射的方法免疫大耳白兔，多次加強免疫后第10 d抽取血清，用ELISA檢測抗體滴度，以免疫前抽取的兔血清為對照，其效價達到1∶104，可以取血收集血清（圖6）。

2.7 Western印跡檢測兔抗血清的特異性

以兔抗血清對原核表達的SCIRR39-C蛋白進行Western印跡檢測，圖7顯示該蛋白條帶可被檢測到，且其相對分子質(zhì)量與預期的SCIRR39-C一致，說明制備的抗血清結(jié)合性較好。

3 討論

圖4 SDS-PAGE檢測GST-SCIRR39-C的純化

圖5 SDS-PAGE檢測GST-SCIRR39-C融合蛋白凝血酶切結(jié)果

圖6 ELISA檢測抗體效價

圖7 Western印跡檢測Anti-SCIRR39的抗體特異性

由于SCIRR39是新近發(fā)現(xiàn)的大鼠RNase抑制劑（RNH）的同源蛋白[6-7]，目前尚無針對其的商業(yè)化特異性抗體，而為了研究SCIRR39在神經(jīng)系統(tǒng)的分布及其在脊髓損傷/修復過程中可能的作用[8-10]，以至其他功能，我們要制備針對其的特異性抗體。為此，我們采用GST融合蛋白表達系統(tǒng)表達重組SCIRR39。該表達系統(tǒng)可以高效表達融合蛋白，且產(chǎn)物易純化，用凝血酶切除GST也比較容易。但由于原核細胞中缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，以及在重組蛋白表達過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，且表達環(huán)境不同于真核細胞，無法形成正確的次級鍵等原因，故使得表達的融合蛋白很難折疊成正確的空間構(gòu)象。我們在表達SCIRR39全長蛋白時就遇到這方面的重重困難，由于蛋白序列中含有多達32個Cys殘基，很可能在表達過程中發(fā)生二硫鍵錯配，使得我們沒有得到目的蛋白。而通過降低誘導溫度和IPTG濃度等方法也沒有提高蛋白的可溶表達量，這種極少量的目的蛋白對于抗體制備來說是遠遠不夠的。因此，我們選擇表達抗原表位的方法制備抗體。通過抗原表位分析，選擇C端359～461位103個氨基酸殘基作為SCIRR39的抗原表位，免疫家兔制備多克隆抗體。經(jīng)過對宿主菌的選擇及誘導條件的優(yōu)化，我們將構(gòu)建的重組質(zhì)粒誘導表達；之后用純化的SCIRR39免疫成年日本大耳白兔，得到了針對SCIRR39的多克隆抗體[11]，該兔抗血清的ELISA效價約為1∶104，表明抗血清具有較好的特異性。SCIRR39重組蛋白多克隆抗體的成功制備，為進一步深入研究其生物學功能提供了良好的工具。

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