A→O血型轉(zhuǎn)變制備通用型紅細(xì)胞過程中殘留α-N-乙酰半乳糖胺酶檢測(cè)方法的建立

高紅偉 ，李素波 ，鮑國強(qiáng) ，張雪 ，徐麗娟 ，檀英霞 ，王穎麗 ，季守平 ，宮鋒

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850；b.附屬醫(yī)院輸血科，北京 100071

紅細(xì)胞血型轉(zhuǎn)變技術(shù)是解決血型錯(cuò)配和血液浪費(fèi)的重要技術(shù)之一。本研究室于1999年開始血型轉(zhuǎn)變工作，已成功地將B型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镺型，并獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的臨床研究批文[1-2]。由于A型紅細(xì)胞的抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，A型紅細(xì)胞血型改造工作在國內(nèi)外都進(jìn)展不大，直到2007年，ZymeQuest公司的Liu等從原核生物中克隆并表達(dá)了新型的α-N-乙酰半乳糖胺酶（α-N-acetylgalactos?aminidase，NAGA），開始了A型紅細(xì)胞血型轉(zhuǎn)變的新紀(jì)元[3]。本研究室也同期開展了A→O血型轉(zhuǎn)變的研究工作，并從國內(nèi)臨床的腦膜膿毒性金黃桿菌（Elizabethkingia meningosepticum）標(biāo)本中克隆出新型NAGA基因，用于A→O血型轉(zhuǎn)變研究。重組表達(dá)的NAGA底物專一性強(qiáng)、比活力高，在接近紅細(xì)胞的生理?xiàng)l件下，能成功地將A型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镺型紅細(xì)胞[4]。

酶解轉(zhuǎn)變的O型紅細(xì)胞用于臨床的關(guān)鍵問題之一就是不能攜帶任何外源蛋白進(jìn)入人體，因此檢測(cè)酶解改造O型紅細(xì)胞中是否殘留NAGA及確定其殘留量是必須解決的問題。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)（ELISA）是檢測(cè)微量蛋白的常規(guī)方法之一，可以檢測(cè)到納克（ng）級(jí)的微量蛋白。由于市場(chǎng)上沒有針對(duì)腦膜膿毒性金黃桿菌NAGA的商品化抗體出售，因此我們自制了NAGA的兔多抗，并進(jìn)行了特異性驗(yàn)證[5]。另外，本研究室克隆的NAGA的C端帶有6×His標(biāo)簽，因此我們擬利用NAGA的兔多抗和抗His的單抗，采用間接ELISA法檢測(cè)A→O血型轉(zhuǎn)變終產(chǎn)品中及洗滌過程中NAGA的殘留量，為酶解法制備的通用型紅細(xì)胞的安全性評(píng)價(jià)提供簡(jiǎn)單實(shí)用的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

健康人A型血由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科提供；重組NAGA（純度＞95%）為本研究室制備[4]；NAGA的兔多抗（rProtein A純化，純度＞95%，效價(jià)1∶1×105）為本研究室制備[5]；鼠抗 His單抗、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG為中杉公司產(chǎn)品；TMB為Sigma公司產(chǎn)品；紅細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。紅細(xì)胞專用水平離心機(jī)為KUBOTA 2100；紅細(xì)胞酶解反應(yīng)箱由本研究室和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器中心聯(lián)合研制。

1.2 微量NAGA檢測(cè)方法的建立

采用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。以10 μg/mL NAGA兔多抗包被酶聯(lián)板（100 μL/孔），4℃濕盒中孵育過夜，次日洗板封閉后加入不同濃度的NAGA（從微克級(jí)依次梯度稀釋至皮克級(jí)），37℃孵育1 h，洗板后加入100 μL抗His單抗（1∶3000稀釋），37℃孵育0.5 h，洗板后加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶10 000稀釋），37℃孵育0.5 h，洗板，TMB顯色，檢測(cè)D450nm值，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 紅細(xì)胞的酶解

將健康人A型血于2000 r/min離心5 min，去上清，取1 mL壓積紅細(xì)胞（packed red blood cells，pRBC），用酶解緩沖液（250 mmol/L甘氨酸，3 mmol/L NaCl，pH6.8）按1∶4的體積比洗2次，按0.015 mg/mL pRBC加入NAGA，放入紅細(xì)胞酶解反應(yīng)箱中于26℃緩慢上下振蕩孵育1 h，待血型轉(zhuǎn)變?yōu)镺型后停止孵育，用PBS按1∶4的體積比洗滌紅細(xì)胞4次，2000 r/min離心5 min后棄上清，保留每次洗滌上清和每次洗滌后的紅細(xì)胞以備檢測(cè)。

1.4 殘留酶的檢測(cè)

對(duì)4次洗滌上清用上述建立的間接ELISA方法直接進(jìn)行檢測(cè)，每次洗滌后獲得的紅細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液按1∶9的體積比裂解后檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 微量NAGA檢測(cè)方法的建立

采用間接ELISA法，經(jīng)過3次獨(dú)立重復(fù)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本一致，在1～15 ng/mL區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。本法的檢測(cè)下限為1 ng/mL。

2.2 殘留酶的檢測(cè)結(jié)果

將4次洗滌上清和每次洗滌后的紅細(xì)胞裂解液用上述建立的間接ELISA方法直接進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表1。通過對(duì)洗滌后的紅細(xì)胞和洗滌液中殘留酶量的檢測(cè)，確定經(jīng)過4次洗滌后，殘留酶量達(dá)到檢測(cè)水平以下。

圖1 微量NAGA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 通用型紅細(xì)胞制備過程中殘留NAGA的檢測(cè)

3 討論

在A→O血型轉(zhuǎn)變過程中，NAGA是惟一引入的外源蛋白，因此在A→O酶解轉(zhuǎn)變反應(yīng)完成后，將NAGA清洗到安全微量，是通用型紅細(xì)胞臨床前研究中必須解決的問題。在B→O血型轉(zhuǎn)變的研究中，美國紐約血液研究中心在洛克菲勒醫(yī)院臨床研究中心進(jìn)行的臨床試驗(yàn)結(jié)果證明，當(dāng)一個(gè)單位（200 mL）的通用型紅細(xì)胞（由B型紅細(xì)胞酶解制備的O型紅細(xì)胞）中殘留的α-半乳糖苷酶總量為2.6±1.9 μg（相當(dāng)于22.5 ng/mL）時(shí)，受試的4名健康成年人均未產(chǎn)生抗α-半乳糖苷酶抗體[6]。參考美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)贐→O研究中最后確定制備的酶解轉(zhuǎn)變的人O型紅細(xì)胞（ECHORBC）中殘留α-半乳糖苷酶的安全劑量為10 ng/mL[7]。關(guān)于A→O血型轉(zhuǎn)變中通用型紅細(xì)胞中殘留NAGA的安全劑量，至少也應(yīng)達(dá)到納克級(jí)，因此，我們需要建立能夠檢測(cè)納克級(jí)NAGA的方法。

我們?cè)鴪?bào)道用SDS-PAGE銀染法結(jié)合酶活性測(cè)定來檢測(cè)由B型血制備的通用型血中α-半乳糖苷酶的殘留量[7]，但這種方法的最低檢測(cè)限為10 ng/孔，因此檢測(cè)下限只能到1 μg/mL，為了檢測(cè)洗滌上清中的殘留酶量，必須將洗滌上清超濾濃縮后再檢測(cè)，步驟較繁瑣且不能準(zhǔn)確定量。ELISA是檢測(cè)微量蛋白的常規(guī)方法之一，可檢測(cè)到納克級(jí)的微量蛋白。因此我們自制了NAGA的特異性兔多抗，利用此兔多抗和抗His的單抗，建立了間接ELISA法檢測(cè)A→O血型轉(zhuǎn)變終產(chǎn)品中及洗滌過程中NAGA殘留量的方法，結(jié)果顯示該方法的檢測(cè)下限為1 ng/mL，在我們需要的檢測(cè)范圍（1～15 ng/mL）具有良好的線性關(guān)系（R2=0.997）。該方法不僅比SDS-PAGE銀染法、酶活性測(cè)定法靈敏，還具備操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為酶解法制備的通用型紅細(xì)胞的安全性評(píng)價(jià)提供了簡(jiǎn)單實(shí)用的檢測(cè)方法。

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