人p53啟動子螢光素酶報告基因的構建及其活性測定

劉家宏 ，徐小潔 ，符靜 ，范忠義 ，呂朝暉 ，陸菊明 ，肖文華 ，葉棋濃 ，朱建華

1.解放軍總醫(yī)院 a.第一附屬醫(yī)院腫瘤科，北京 100037；b.內(nèi)分泌科，北京 100853；

2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

隨著老齡化社會的加速及生存環(huán)境、生活方式的改變，惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率逐漸升高，成為威脅人類生命健康的重要因素。腫瘤抑制因子p53是迄今發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系最為密切的抑癌基因[1]。研究表明[2]，50%以上的惡性腫瘤病人發(fā)生了p53基因突變。由于點突變、基因片段缺失和p53蛋白失活等導致的p53功能缺陷，可通過多種分子機制引起細胞過度增殖和遺傳物質(zhì)的改變，逃避機體對癌變細胞的免疫監(jiān)控作用,最終導致腫瘤的發(fā)生[3]。p53與機體免疫系統(tǒng)的功能和免疫反應關系密切，表現(xiàn)在：一方面，p53，尤其是突變型p53可以作為腫瘤相關抗原激發(fā)機體免疫反應；另一方面，p53可以直接啟動免疫細胞中一些基因的表達，從而對這些細胞的增殖和功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，以達到殺傷腫瘤細胞的目的[4]。因此，尋求增加內(nèi)源性p53蛋白的表達，可以成為治療腫瘤的一個突破點。

基因表達可以在不同水平上進行調(diào)控，其中轉錄水平的調(diào)控是調(diào)控表達的關鍵環(huán)節(jié)。轉錄因子是廣泛存在于機體各種組織、細胞中能夠結合靶序列的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能夠調(diào)控特定基因的轉錄，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤、轉移中起重要作用。為了研究p53在轉錄水平上的調(diào)控，篩選出新的調(diào)控p53的轉錄因子，我們從人HepG2細胞基因組中擴增出p53基因約3 kb的啟動子，將其克隆至螢光素酶報告基因載體pGL4.0-empty中，為研究p53的轉錄調(diào)控和尋找治療腫瘤的新靶點奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

SV40病毒轉化的人胚胎腎293T細胞、乳腺癌ZR75-1細胞、肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞由本室傳代培養(yǎng)；pGL4.0-empty載體及螢光素酶底物購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、Prim?erStar酶購自TaKaRa公司；DNA純化試劑盒購自申能博彩公司；DMEM培養(yǎng)基及小牛血清均購自Gibco公司；Vigofect轉染試劑購自Vigorous公司。引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。

1.2 人p53啟動子片段的擴增

以人肝癌細胞HepG2的基因組為模板，在NCBI網(wǎng)站搜索并合成p53啟動子序列。上游引物為5'-GGGGTACCAGCCTTCACATGACTGATCCCTTAT CCTC-3'，下游引物為5'-CCGCTCGAGGAAAACCC CAATCCCATCAACCCCT-3'。上下游引物5'端分別攜帶KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點。PCR反應條件：95℃ 5 min；94℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 3 min，30個循環(huán)；72℃ 7 min。

1.3 重組質(zhì)粒的構建與測序

在37℃下，用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切pGL4.0-empty載體4 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR產(chǎn)物回收后再用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切，用T4DNA連接酶連接入pGL4.0-empty載體。轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒，KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.4 哺乳動物細胞的培養(yǎng)及轉染

按常規(guī)方法進行轉染[5]，用不含雙抗、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將人胚腎293T細胞接種于24孔板中，接種量以轉染時細胞密度達到80%為宜，培養(yǎng)24 h后進行轉染。將總量為1.0 μg的質(zhì)粒與25 μL 生理鹽水混合，再將 0.5 μL Vigofect與 25 μL生理鹽水混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入24孔板中，37℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。

1.5 螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性測定

螢光素酶活性測定基本按Promega公司的試劑盒說明書進行。轉染細胞后，吸掉培養(yǎng)基，用PBS洗1次，加入100 μL裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，刮下細胞，收集到1.5 mL的離心管中，振蕩5 min，4℃、12 000 r/min離心3 min，收集上清液，用熒光劑測量熒光值。

用ONPG測定β-半乳糖苷酶活性。將30 μL上述上清液與100 μL預先以9∶2混勻的Z緩沖液/β-巰基乙醇∶ONPG溶液混合，37℃溫育，直到出現(xiàn)淺黃色為止；加入250 μL濃度為1 mol/L的Na2CO3終止顏色反應,測定樣品的D420nm值。取熒光值平均值與對應的β-半乳糖苷酶活性值相除，將未加重組質(zhì)粒的數(shù)值歸一，與此相比所得倍數(shù)為最終結果。

2 結果

2.1 人p53啟動子的PCR擴增

以人肝癌細胞系HepG2細胞的基因組為模板，PCR擴增p53的啟動子序列，PCR產(chǎn)物約3000 bp，與預期片段大小一致（圖1）。

2.2 p53啟動子報告基因的構建與鑒定

用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物后，克隆到經(jīng)同樣雙酶切的pGL4.0-empty載體中，轉化大腸桿菌DH5α，挑選的陽性克隆提質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，得到與預期長度一致的插入片段,而空載體酶切只見一條載體帶（圖2），表明p53啟動子已插入pGL4.0-empty上游的多克隆位點中。測序結果證實與已知序列一致（數(shù)據(jù)略）。

2.3 293T細胞中p53啟動子活性的測定

圖1 目的基因的PCR擴增

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

在293T細胞中，分別轉染pGL4.0-empty和不同濃度梯度的pGL4.0-pp53，螢光素酶活性測定結果見圖3。與空載體相比，轉染重組質(zhì)粒后螢光素酶活性明顯提高，且螢光素酶活性隨轉染劑量的升高逐漸增高，說明pGL4.0-pp53在293T細胞中具有轉錄活性，且轉錄活性呈現(xiàn)一定的劑量效應。

2.4 ZR75-1、HepG2、A549細胞中p53啟動子活性的測定

為了驗證p53啟動子的活性是細胞特異性還是在多種細胞中有廣泛效應，將pGL4.0-pp53重組質(zhì)粒分別轉染人乳腺癌ZR75-1細胞、肝癌HepG2細胞及肺癌A549細胞，24 h后收集細胞測定螢光素酶活性。結果見圖4，與空載體相比，轉染重組質(zhì)粒后ZR75-1、HepG2、A549細胞中的螢光素酶活性提高了幾倍至數(shù)十倍，表現(xiàn)了重組質(zhì)粒中的p53啟動子活性，說明p53啟動子在多種細胞中具有轉錄活性。

2.5 轉錄因子USF對p53報告基因轉錄的影響

轉錄因子USF是一種已知的能升高p53轉錄水平的轉錄因子[6]，我們通過檢測轉錄因子USF對p53啟動子轉錄活性的影響，驗證了pGL4.0-pp53的活性及功能，結果見圖5。在293T細胞中，將不同劑量的USF和pGL4.0-pp53共轉，螢光素酶活性檢測結果顯示，隨著轉錄因子USF劑量的增加，p53啟動子的轉錄活性也逐步增加，說明USF對p53的活性調(diào)節(jié)呈劑量依賴效應，也進一步表明我們所構建的pGL4.0-pp53具有與文獻報道一致的活性及功能。

3 討論

惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命的重要疾病之一，目前全球約有1000萬人患有惡性腫瘤，每年有800余萬人死于惡性腫瘤，而且這一數(shù)字呈不斷增長的趨勢。由于p53能有效抑制腫瘤細胞增殖，并能參與機體細胞、體液免疫應答，誘導凋亡，因此p53表達的精細調(diào)節(jié)顯得尤為重要?；虮磉_是遺傳信息的轉錄和翻譯過程，可以在不同水平上進行調(diào)控，其中轉錄水平的調(diào)控是調(diào)控表達的關鍵環(huán)節(jié)。轉錄水平的調(diào)控主要依靠轉錄因子的調(diào)節(jié)，轉錄因子之所以能誘導基因轉錄，主要是與目的基因的啟動子相互作用。Damell等[7]也認為，選擇轉錄因子作為抗腫瘤靶點是合理的。野生型p53蛋白的活性形式為四聚體，自N端起依次為轉錄活化區(qū)、DNA結合區(qū)、四聚體化區(qū)和C端調(diào)節(jié)區(qū)，其啟動子區(qū)域不含TATA盒，也沒有富含GC區(qū)域，而后兩者均為促進轉錄開始的重要應答元件。雖然它在互補鏈-80位上含有CAAT盒，但是否有轉錄因子與之結合目前還不甚清楚。p53的轉錄調(diào)節(jié)是一個復雜的過程,其中包括許多已證實和未證實的轉錄調(diào)節(jié)因子。對p53轉錄因子的篩選，可能有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療的靶標。因此，我們構建的p53啟動子調(diào)控的螢光素酶報告基因將在p53轉錄調(diào)節(jié)的研究及篩選新的調(diào)控p53的轉錄因子中發(fā)揮重要作用。

轉錄因子USF是一種細胞編碼的轉錄因子，能夠調(diào)節(jié)某些病毒及基因的轉錄。該因子以位點特異性方式結合CACGTG[8]，在腺病毒中使腺病毒后期啟動子轉錄活性增加3～25倍。USF通過靠近蛋白N端的2個轉錄激活區(qū)域激活靶基因轉錄活性，而起始蛋白TFⅡ-Ⅰ也參與這一過程?；钚詼y定結果顯示，轉錄因子USF能明顯增高p53的活性，與文獻報道相符，證明我們所構建的p53啟動子的螢光素酶報告基因是可靠并具有活性的。

另外，本實驗構建的p53啟動子調(diào)控的螢光素酶報告基因序列已知，且是天然存在的。螢光素酶報告基因系統(tǒng)操作簡便，檢測靈敏，可以一次篩選多個轉錄因子，這為發(fā)現(xiàn)新的p53轉錄因子奠定了扎實的實驗基礎。

圖3 不同劑量p53啟動子活性的測定

圖4 不同細胞中p53啟動子活性的測定

圖5 不同劑量USF對p53啟動子報告基因的影響

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