DEK真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)p53啟動(dòng)子活性的影響

劉婕 ，閆志風(fēng) ，張亞楠 ，林婭紅 ，丁麗華 ，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853

原癌基因dek最初是從急性髓系白血病患者骨髓細(xì)胞中以dek-can融合基因的形式分離而來(lái)的[1]。研究表明，DEK與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。DEK在許多惡性腫瘤如肝細(xì)胞癌、膀胱癌、惡性黑色素瘤和宮頸癌中均有過(guò)表達(dá)[2-4]。DEK可以誘發(fā)人類乳頭狀瘤病毒（HPV）E7靶基因癌變，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。同時(shí)，在乳腺癌中DEK的表達(dá)也明顯升高，而且與腫瘤的分級(jí)、分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，在惡性度高和晚期乳腺癌中可以作為一個(gè)特異性的靶基因。最近研究發(fā)現(xiàn)，DEK與DNA結(jié)合影響染色質(zhì)重構(gòu)和基因表達(dá)，并且可以抑制依賴p53蛋白和不依賴p53蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞衰老和凋亡[6]。因此，我們從乳腺cDNA文庫(kù)中獲得了DEK全長(zhǎng)編碼序列,構(gòu)建了N端帶Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體。人胚腎293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高，常用來(lái)檢測(cè)真核基因的表達(dá)，我們將構(gòu)建的DEK表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)其表達(dá)。為了檢測(cè)DEK在乳腺癌中的作用機(jī)制，我們利用構(gòu)建的真核表達(dá)載體，在乳腺癌ZR75-1細(xì)胞中檢測(cè)了DEK對(duì)p53基因啟動(dòng)子活性的影響，發(fā)現(xiàn)在ZR75-1細(xì)胞中，DEK降低了p53啟動(dòng)子的活性。我們的研究為進(jìn)一步檢測(cè)DEK在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)，并預(yù)示DEK可能成為將來(lái)檢測(cè)和治療乳腺癌的靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T細(xì)胞、乳腺癌ZR75-1細(xì)胞、p53全長(zhǎng)啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，pfu酶和DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取、膠回收和PCR回收試劑盒均為Pro?mega公司產(chǎn)品；PCR引物由北京賽百盛生物有限公司合成；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE2000購(gòu)自Invitro?gen公司；鼠抗人Flag抗體購(gòu)自Bethyl Laboratories公司；兔抗人GAPDH和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG抗體購(gòu)自SantaCruz公司。

1.2 DEK編碼序列的PCR擴(kuò)增

dek基因序列GenBank登錄號(hào)為NM_003472，根據(jù)GenBank中報(bào)告的序列設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的上游引物（5'-CGGGATCCATGTCCGCCTCGGCCCCTGC-3'）和 下 游 引 物（5'-CGGAATTCTCAAGAAATTAG CTCTTTTACAG-3'），上下游引物5'端分別攜帶BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。PCR模板為人乳腺文庫(kù)。PCR反應(yīng)條件：95℃變性1 min；95℃變性30 s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，29個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR擴(kuò)增所用的酶為pfu酶。

1.3 pcDNA3-Flag載體的構(gòu)建

以乳腺文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增dek基因序列，切膠回收目的條帶，37℃下用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切dek基因片段與pcDNA3-Flag載體，4 h后切膠回收酶切產(chǎn)物，于16℃連接8 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取平板上的克隆至LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒再經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定。

1.4 Western印跡

轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞，加入SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉1∶1000稀釋的Flag抗體或1∶10 000稀釋的GAPDH抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性測(cè)定

螢光素酶活性測(cè)定按Promega公司試劑說(shuō)明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后棄培養(yǎng)基，用PBS洗1次，加入100 μL裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，將細(xì)胞收集到1.5 mL離心管中，振蕩5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清，取15 μL上清液，用熒光計(jì)測(cè)定螢光素酶活性。

再取上述上清液10 μL與90 μL含β-巰基乙醇（2.7 ml/L）的Z緩沖液混勻，加入20 μL 4 mg/mL的ONPG溶液，常溫放置至出現(xiàn)淺黃色，加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測(cè)定 D420nm值，其中β-半乳糖苷酶活性用于校正細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，啟動(dòng)子活性為細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率校正后的螢光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 dek基因的PCR擴(kuò)增

以乳腺文庫(kù)為模板，用PCR方法擴(kuò)增DEK全長(zhǎng)編碼序列，長(zhǎng)度應(yīng)為1128 bp，DNA凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.2 pcDNA-3-Flag-DEK載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增的DEK編碼序列和pcDNA3-Flag用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切處理，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，抗性篩選得到的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性（未顯示）。PCR鑒定陽(yáng)性者再用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果進(jìn)一步表明雙酶切后在1128 bp處可見(jiàn)特異片段，而空載體對(duì)照無(wú)此片段（圖2）。DNA序列分析結(jié)果證實(shí)該插入片段為DEK編碼序列（結(jié)果未顯示）。

2.3 pcDNA3-Flag-DEK載體在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

將上述陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag空載體，24 h后裂解細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DEK的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果見(jiàn)圖3，轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-DEK載體的細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約43×103的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明pcDNA3-Flag-DEK載體攜帶的DEK編碼序列能在293T細(xì)胞中表達(dá)。

圖1 PCR擴(kuò)增dek基因

圖2 pcDNA-3-Flag-DEK的雙酶切鑒定

2.4 不同劑量DEK對(duì)p53啟動(dòng)子活性的影響

p53全長(zhǎng)啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒與不同劑量DEK表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ZR75-1乳腺癌細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)螢光素酶活性，測(cè)定DEK對(duì)p53啟動(dòng)子活性的影響。方法如前所述，啟動(dòng)子活性為細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率校正后的螢光素酶活性，即為螢光素酶活性/β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果見(jiàn)表1，與對(duì)照組相比，0.1 μg DEK的表達(dá)即可使p53啟動(dòng)子活性降至約1/7；當(dāng)DEK表達(dá)量增加至1 μg時(shí)，p53啟動(dòng)子活性降至約1/20。表明DEK明顯抑制p53啟動(dòng)子的活性，且對(duì)p53啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)呈劑量依賴關(guān)系（圖4，P＜0.05）。因此，DEK可能是調(diào)控p53啟動(dòng)子活性的新轉(zhuǎn)錄因子。

3 討論

dek在多種人類侵襲性腫瘤中均表達(dá)上調(diào)，是很重要的癌基因。也有研究發(fā)現(xiàn)，DEK過(guò)表達(dá)抑制HeLa細(xì)胞的衰老，并延長(zhǎng)人膠質(zhì)細(xì)胞的壽命；DEK表達(dá)缺失可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。因此，DEK可以抑制細(xì)胞衰老和細(xì)胞凋亡[6]。p53是人類很重要的抑癌基因，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部或外部應(yīng)激反應(yīng)（如DNA損傷）時(shí)，p53蛋白被活化，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。某些因素引起p53基因突變或功能喪失，是引發(fā)宮頸癌的重要因素，宮頸癌組織中突變型p53蛋白的表達(dá)率明顯高于慢性宮頸炎。Trisha等發(fā)現(xiàn)，DEK通過(guò)促進(jìn)p53的降解而抑制細(xì)胞凋亡，且DEK抑制p53下游基因p21和Bax的表達(dá)[6]。為了進(jìn)一步研究DEK在腫瘤中的作用，我們構(gòu)建了DEK的真核表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)DEK明顯抑制p53啟動(dòng)子的活性。因此，除已報(bào)道的DEK在蛋白水平調(diào)節(jié)p53表達(dá)[8]外，我們首次發(fā)現(xiàn)DEK在轉(zhuǎn)錄水平同樣抑制p53啟動(dòng)子活性，可能是調(diào)節(jié)p53表達(dá)的新的轉(zhuǎn)錄因子，說(shuō)明DEK在p53的功能發(fā)揮中具有重要的調(diào)控作用。后續(xù)，我們將進(jìn)一步研究DEK調(diào)節(jié)p53啟動(dòng)子的功能及機(jī)制。綜上，我們成功地得到DEK表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究DEK在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，以及臨床分子靶向治療奠定了基礎(chǔ)。

圖3 Western印跡檢測(cè)Flag-DEK在293T細(xì)胞中的表達(dá)

圖4 不同劑量DEK對(duì)p53啟動(dòng)子活性的影響

表1 不同劑量DEK對(duì)p53啟動(dòng)子活性的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）

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