敲低GATA1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及敲低效果檢測(cè)

張亞楠，劉婕，林婭紅，周蕾，丁麗華，葉棋濃

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

GATA1是轉(zhuǎn)錄因子GATA蛋白家族成員，1991年被首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道。GATA1可以與［T/A（GATA）A/G］序列結(jié)構(gòu)特異結(jié)合，隨后GATA2～GATA6逐一被報(bào)道，形成GATA家族。GATA1是造血系統(tǒng)特有的轉(zhuǎn)錄因子，為正常紅細(xì)胞發(fā)育所必需，不僅存在于紅系細(xì)胞中，在巨核細(xì)胞系和肥大細(xì)胞系中也有很高的含量[1-2]。GATA1調(diào)控紅細(xì)胞的分化和成熟，在巨核細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中具有多功能性，可影響細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和成熟。同時(shí)，GATA1的點(diǎn)突變可導(dǎo)致白血病的發(fā)生，GATA1與伴有嚴(yán)重貧血的多發(fā)性骨髓瘤也有密切關(guān)系[3]。由此可見(jiàn)，GATA1在造血細(xì)胞系中有很高的含量，與很多血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，也與人類身體健康息息相關(guān)[4]。我們的研究表明，GATA1在除了造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)外，在其他類型的細(xì)胞中（如本文的人胚腎細(xì)胞）也有表達(dá)，提示GATA1在實(shí)體腫瘤中也有作用。由于GATA1在實(shí)體瘤中的作用只在乳腺癌中有所報(bào)道，因此深入研究GATA1在實(shí)體腫瘤中的功能及其分子機(jī)制具有十分重要的意義。

我們用構(gòu)建慢病毒載體的小發(fā)夾RNA（shRNA）技術(shù)抑制GATA1的表達(dá)，與普通轉(zhuǎn)染方法相比能獲得更高的感染效率，以便為GATA1的后續(xù)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000、TRIzol均購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；慢病毒表達(dá)載體購(gòu)自SBI公司，包含pSIH1-H1-Puro載體和pPack Packaging Plasmid Mix載體；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、實(shí)時(shí)定量PCR試劑均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；兔抗人GATA1抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗人GAPDH和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG均購(gòu)自Santa Cruz公司；引物由北京賽百盛生物有限公司合成；質(zhì)粒測(cè)序分析由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成；實(shí)時(shí)定量PCR儀為ABI PRISM 7000型。

1.2 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建

根據(jù)shRNA靶序列篩選設(shè)計(jì)原則，結(jié)合人GATA1的基因序列和網(wǎng)站分析，選擇確定一條特異性shRNA靶序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)確定的靶序列進(jìn)行Blast分析，證明與其他已知基因沒(méi)有同源性，然后設(shè)計(jì)合成寡核苷酸的正義鏈和反義鏈進(jìn)行退火處理，即先將其分別溶于雙蒸水中，等摩爾數(shù)混合后95℃加熱5 min，自然降溫至37℃，形成雙鏈的寡核苷酸。將退火的shRNA序列插入經(jīng)酶切的pSIH1-H1-Puro載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證。GATA1 shRNA的上游序列為5'-TAGTG CTTATGGGGGCCCTGACTTT-3'，下游序列為5'-AA AGTCAGGGCCCCCATAAGCACTA-3'。

1.3 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

細(xì)胞用含10%新生牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，用不含雙抗、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將人胚腎293T細(xì)胞接種于12孔板中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到80%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將總量2 μg的質(zhì)粒與50 μL無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基混合，再將1 μL Vigorous與50 μL無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入12孔板中，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞。

1.4 Western印跡

人胚腎293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入SDS-PAGE加樣緩沖液，煮沸15 min，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉過(guò)夜，然后用以5%脫脂奶粉稀釋的抗GATA1多克隆抗體室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次6 min；加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次6 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 細(xì)胞RNA提取和RT-PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后收集人胚腎293T細(xì)胞，加入TRIzol提取細(xì)胞總RNA，取2 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈，以之為模板，用實(shí)時(shí)定量PCR儀分別擴(kuò)增GATA1 cDNA［引物為 Forward（5'-TGGAGACTTTG AAGACAGAGCGGCTGAG-3'）和 Reverse（5'-GAAG CTTGGGAGAGGAATAGGCTGCTGA-3'）］和 β-actin內(nèi)參基因［引物為Forward（5'-ATCACCATTGGCA ATGAGCG-3'）和 Reverse（5'-TTGAAGGTAGTTTC GTGGAT-3'）］，并收集熒光信號(hào)，用 2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)分析。

2 結(jié)果

2.1 GATA1 siRNA慢病毒載體的構(gòu)建

將合成的2條引物進(jìn)行退火處理后，將退火產(chǎn)物和2條引物一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1），結(jié)果顯示退火產(chǎn)物的條帶水平位置位于2條引物的上方，證明退火成功。轉(zhuǎn)化后挑取GATA1 siRNA慢病毒載體克隆，DNA測(cè)序結(jié)果顯示GATA1 siRNA序列已插入pSIH1-H1-Puro載體，序列與預(yù)期完全一致（圖2），證明GATA1 siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 GATA1 siRNA對(duì)GATA1基因表達(dá)的影響

圖1 GATA1 siRNA退火結(jié)果

圖2 GATA1 siRNA慢病毒載體的測(cè)序結(jié)果

在有內(nèi)源性GATA1表達(dá)的293T細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染GATA1 siRNA及對(duì)照siRNA，48 h后收集蛋白，用GATA1抗體進(jìn)行Western印跡（圖3）。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，GATA1 siRNA能明顯抑制內(nèi)源性GATA1的表達(dá)，而同時(shí)用GAPDH抗體檢測(cè)并沒(méi)有明顯的改變。由此可見(jiàn)，所設(shè)計(jì)的GATA1 siRNA能夠有效降低GATA1基因的表達(dá)。

2.3 GATA1 siRNA對(duì)GATA1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

在有內(nèi)源性GATA1表達(dá)的293T細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染GATA1 siRNA及對(duì)照siRNA，48 h后收取細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，利用RT-PCR鑒定GATA1 siRNA的抑制效果（圖4）。RT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，GATA1 siRNA轉(zhuǎn)染組的mRNA水平顯著降低，說(shuō)明構(gòu)建的GATA1 siRNA能夠有效抑制293T細(xì)胞GATA1基因的轉(zhuǎn)錄水平。

圖3 Western印跡檢測(cè)GATA1 siRNA的敲低效果

圖4 RT-PCR檢測(cè)GATA1 siRNA的敲低效果

3 討論

RNA干擾（RNAi）是近年發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象，是由雙鏈RNA介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。慢病毒載體是源于人免疫缺陷病毒1（HIV-1）的一種病毒載體，包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。攜帶外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過(guò)感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中的表達(dá)。將慢病毒載體作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性的使基因表達(dá)沉默的能力，還能充分發(fā)揮自身所具備的優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，我們所構(gòu)建的GATA1 siRNA慢病毒表達(dá)載體具有顯著的干擾效果。

轉(zhuǎn)錄因子GATA1在正常紅細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中起重要的生物學(xué)作用，且控制著巨核細(xì)胞、肥大細(xì)胞核嗜酸性細(xì)胞的分化。GATA1可以和許多生物大分子相互作用[5]，在血小板減少癥、多發(fā)性骨髓瘤、白血病等疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)[6-7]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，我們構(gòu)建的GATA1 siRNA慢病毒表達(dá)載體可以降低GATA1基因的表達(dá)水平，同時(shí)也能有效抑制GATA1的轉(zhuǎn)錄水平。GATA1作為一個(gè)潛在的癌基因，在諸多血液疾病中發(fā)揮重要作用，可能成為腫瘤基因治療的靶標(biāo)[8-9]。但是，GATA1在實(shí)體腫瘤中的作用還很不清楚。綜上，GATA1 siRNA慢病毒載體的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步研究GATA1多方面的功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]Joan B,Peter B,Yoshihiro N,et al.Regulation of activity of the transcription factor GATA-1 by acetylation[J].Nature,1998,396(6711):594-598.

[2]馮雪梅，祝彼得.GATA-1的研究現(xiàn)狀[J].四川醫(yī)學(xué),2006,27(2):132-134.

[3]吳秀麗,李揚(yáng)秋.轉(zhuǎn)錄因子GATA-1在造血系統(tǒng)中的作用（綜述）[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2002,23(6):21-26.

[4]Benjamin D,Joanna K,Laura G,et al.Vegf regulates embry?onic erythroid development through Gata1 modulation[J].Blood,2010,116(12):2141-2151.

[5]Christiane L B,Milton A E,Jagman C,et al.Differential re?quirement for Gata1 DNA binding and transactivation between primitive and definitive stages of hematopoiesis in zebrafish[J].Blood,2009,114(25):5162-5172.

[6]Boidot R,Vegtan F,Jacob D,et al.The transcription factor GATA-1 is overexpressed in breast carcinomas and contrib?utes to survivin upregulation via a promoter polymorphism[J].Oncogene,2010,29(17):2577-2584.

[7]Rena Z,Gerd A.GATA transcription factors and cancer[J].Genes Cancer,2011,1(12):1178-1188.

[8]Rita F,Kinuko O,Masayuki Y,et al.GATA1 function,a par?adigm for transcription factors in hematopoiesis[J].Mol Cell Bi?ol,2005,25(4):1215-1227.

[9]Wendy A C,Wendy H R,Melissa A K.Human phenotypes associated with GATA-1 mutations[J].Genes,2008,427(1-2):1-6.