果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展

邢曉華 ，楊曉明 ，徐平

1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；

2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206

果蠅（Drosophila melanogaster）是一種雙翅目（Diptera）昆蟲，因喜好腐爛的水果及發(fā)酵的果汁而得名。由于個體小、繁殖快、生活史豐富、染色體少、突變多等一系列優(yōu)點，果蠅已成為生命科學(xué)領(lǐng)域最常用的一種模式生物[1]。

果蠅是多細胞生物，具有復(fù)雜的發(fā)育過程和豐富的行為學(xué)特征，與人類在身體發(fā)育、神經(jīng)退化、腫瘤形成等的調(diào)控機制上有很多相通之處，其調(diào)控規(guī)律也與人類極其相似，許多人類基因在果蠅上也有，甚至功能可以互通[2]。因此，在20世紀生命科學(xué)發(fā)展的歷史長河中，果蠅扮演了十分重要的角色。遺傳學(xué)、發(fā)育的基因調(diào)控、各類神經(jīng)疾病、帕金森病、老年癡呆、藥物成癮和酒精中毒、衰老與長壽、記憶與某些認知行為的研究中都有果蠅的“身影”[3]。目前果蠅基因組方面的研究也已相當(dāng)成熟。2000年，果蠅全基因組測序完成。該基因組中編碼蛋白質(zhì)的基因有13 600多個，數(shù)量少于線蟲。但因果蠅存在復(fù)雜的生活史和形態(tài)變化，因此其基因的功能調(diào)控更為復(fù)雜多樣。長期的系統(tǒng)研究也使果蠅的基因組成為至今注釋最好的基因組之一[4]。另外，果蠅擁有目前國際上應(yīng)用最廣泛的在線數(shù)據(jù)庫Flybase，利于對其蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)進行進一步的分析[5]。

盡管果蠅的研究在遺傳學(xué)和基因組方面已非常成熟，但蛋白質(zhì)是生命活動功能的直接承擔(dān)者，在果蠅蛋白質(zhì)組水平的研究可以直接獲得基因在細胞內(nèi)的確切功能，是系統(tǒng)鑒定、定量蛋白質(zhì)，并研究其生物學(xué)功能的重要手段。最重要的是，在蛋白質(zhì)組層面，果蠅作為無脊椎模式生物，在氨基酸序列水平與脊椎動物的同源性最高，結(jié)合果蠅的遺傳學(xué)、基因組學(xué)及生理學(xué)研究技術(shù)基礎(chǔ)，能夠?qū)ζ淙绱素S富且與人類極其相似的生活史調(diào)控規(guī)律進行深度解讀[6]。因此，果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究引起了生命科學(xué)界的廣泛重視，成為當(dāng)今國際生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域最活躍的學(xué)科前沿。

但由于技術(shù)的限制，至今在果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究報道并不多見。我們對近年來的果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究進行了綜述，主要包括果蠅蛋白質(zhì)組的產(chǎn)生背景，以及在表達譜、修飾譜、比較蛋白質(zhì)組學(xué)和疾病模型蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的進展，并對果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展前景進行了展望，為進一步開展人類疾病模型的果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 果蠅及其蛋白質(zhì)組的研究內(nèi)容

果蠅的生活史包括卵、幼蟲、蛹、成蟲等4個連續(xù)的但形態(tài)完全不同的變態(tài)發(fā)育階段。其生活周期十分短暫，在25℃、60%相對濕度條件下約為10 d。通過控制養(yǎng)殖溫度，可以加速或減緩果蠅的發(fā)育。果蠅個體很小，成蟲果蠅體長僅為3～4 mm，且雄性較雌性偏小。果蠅的染色體數(shù)目少，其核型只包括4對同源染色體，其中1對為性染色體，3對為常染色體。果蠅的性別決定方式為XY型，雄性異配，因此常常被用作驗證性別決定的實驗素材[7]。

基于清晰的遺傳背景和便捷的遺傳操作，果蠅在發(fā)育生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域都占據(jù)了不可替代的位置，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域也得到越來越廣泛的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的日臻成熟，對果蠅的研究已遠遠不止停留在基因和遺傳學(xué)的層次上，科學(xué)家更關(guān)注果蠅基因如何調(diào)控蛋白質(zhì)的表達，并進而對生命活動進行直接調(diào)控，揭示人類生命的奧秘。

隨著人類基因組學(xué)計劃的逐漸成熟，分子水平的實驗技術(shù)不斷發(fā)展，果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各個方面均有較大突破，新的研究內(nèi)容和方法不斷出現(xiàn)。

2 果蠅蛋白質(zhì)組表達譜

基于凝膠電泳體系的蛋白質(zhì)鑒定策略是近年來果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究常用的技術(shù)策略，主要包括2種技術(shù)：一是基于2-DE的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，二是基于一維凝膠電泳分離-高效液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（GeLC-MS/MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略。但由于技術(shù)的限制，果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究，尤其是大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報道尚不多見。為得到覆蓋率更高的果蠅蛋白質(zhì)組表達譜，各種新方法不斷產(chǎn)生，比較有效的是將樣品分為不同的組織和器官分別進行鑒定，不但可以提高鑒定率，也可以為研究特定組織和器官提供更為詳盡的蛋白信息，實現(xiàn)生物功能專一性和多樣性（表1）。

2.1 基于2-DE的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

基于2-DE的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法在前期的果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究中占據(jù)主要地位。Alonso等[8]利用2-DE技術(shù)研究了果蠅線粒體的蛋白質(zhì)組，鑒定到231個銀染的多肽，對應(yīng)了66個線粒體蛋白質(zhì)；并且用相似的技術(shù)體系對果蠅成蟲的翅膀胎盤進行了蛋白質(zhì)組分析，共鑒定到1492個多肽，對應(yīng)了100多個蛋白[9]。Vierstraete等[10]利用該技術(shù)對果蠅幼蟲血淋巴的分泌蛋白質(zhì)組進行了分析，分別得到脂多糖、啤酒酵母和藤黃微球菌等3種物質(zhì)感染下發(fā)生免疫的蛋白質(zhì)10、20和19個。Takemori等[11]用相似的技術(shù)體系發(fā)現(xiàn)了440個果蠅雄性生殖系統(tǒng)（包括睪丸、精囊、附屬腺、射精管和射精管球）組織特異的蛋白。Lee等[12]利用雙向電泳技術(shù)鑒定了果蠅頭部中的1500個熒光蛋白點，得到650個蛋白質(zhì)，其中500個屬于果蠅頭部特異的蛋白質(zhì)。

雙向電泳可分離上千種蛋白質(zhì)，并獲得該蛋白的等電點和相對分子質(zhì)量，但也存在不易分離強疏水性、低溶解度、極酸或極堿的蛋白質(zhì)，以及繁瑣、不穩(wěn)定、靈敏度低等缺點[13-14]。

表1 以果蠅為模式生物的蛋白質(zhì)組表達譜研究進展

2.2 基于高效液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)

近幾年中，基于高效液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為主流的全蛋白質(zhì)組研究方法。Bunner等[15]報道了基于LC-MS/MS蛋白質(zhì)組技術(shù)的首例大規(guī)模果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果，選取果蠅卵、幼蟲、蛹和成蟲等4個發(fā)育階段及Kc167和S2等2個細胞系作為研究材料，在多種蛋白提取分離鑒定技術(shù)的支持下，經(jīng)若干次重復(fù)試驗，共鑒定到9124個蛋白，對應(yīng)8672個基因，成為迄今最大規(guī)模的果蠅蛋白質(zhì)組研究。

組織特異和亞細胞水平的蛋白質(zhì)組學(xué)研究是蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的一支新生力量。它一方面降低樣品的復(fù)雜度，使分析簡單化；另一方面可以相對富集相應(yīng)亞細胞結(jié)構(gòu)的低豐度蛋白，而且可以部分提示蛋白質(zhì)的定位和功能信息，成為蛋白質(zhì)鑒定及其功能研究的紐帶。由于果蠅這個多細胞生物的復(fù)雜的發(fā)育過程、豐富的行為學(xué)特征及不斷改進的多種策略和技術(shù)方法，其亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展非常迅速，一些重要的亞細胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組不斷得到分析，并已深入到亞細胞器和復(fù)合體水平。Was?brough等[16]利用LC-MS/MS的方法分離分析了果蠅精子蛋白質(zhì)組，獲得了包含956個精子相關(guān)蛋白的數(shù)據(jù)集。Muller等[17]分析了果蠅胚胎中心體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，共鑒定到蛋白251個。Khanna等[18]利用相似方法研究了質(zhì)膜蛋白質(zhì)組，鑒定了432個蛋白。Cammarato等[19]也利用該方法對145個果蠅心臟組織進行蛋白質(zhì)組分離分析，共鑒定了1228個相關(guān)蛋白質(zhì)。不但如此，亞細胞蛋白質(zhì)組還向更深方向發(fā)展。Anholt等[20]以果蠅觸角為研究材料，初步探索了果蠅的可溶性蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了100多個相關(guān)蛋白。這些有益的嘗試都加深了我們對蛋白質(zhì)在特異組織及細胞內(nèi)的特異表達、轉(zhuǎn)運、定位及其生物學(xué)功能的理解。

3 果蠅蛋白質(zhì)組修飾譜

蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命活動中起著十分重要的作用，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜、功能更為完善、調(diào)節(jié)更為精細、作用更為專一。研究較多的果蠅的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式主要是磷酸化、泛素化、糖基化、類泛素化及組蛋白的甲基化。在體內(nèi)，各種翻譯后修飾過程不是孤立存在的，而是相互作用、共同調(diào)節(jié)的。

3.1 磷酸化修飾

蛋白質(zhì)磷酸化修飾涉及細胞信號傳導(dǎo)、神經(jīng)活動、肌肉收縮及細胞的增殖、發(fā)育和分化等生理、病理過程，在生命活動發(fā)展中發(fā)揮著巨大的作用。Zhai等[21]利用一套完整的磷酸化富集和鑒定體系，包括強陽離子交換色譜、金屬離子親和色譜和高精度的質(zhì)譜體系，在果蠅的胚胎中共鑒定到13 720個磷酸化位點，來自2702個蛋白，建立了當(dāng)時規(guī)模最大的果蠅磷酸化數(shù)據(jù)集。在果蠅的蛋白質(zhì)磷酸化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，人們致力于不斷提高磷酸肽的富集效率和質(zhì)譜的鑒定水平，以此提高果蠅蛋白質(zhì)組的磷酸化修飾譜。Pinkse等[22]利用基于二氧化鈦富集的二維色譜方法，使果蠅S2細胞系的磷酸肽鑒定量與僅借助SCX相比翻了4番，高達2152個，大大加強了磷酸肽的富集效果。Bodenmiller等[23]不但通過改進磷酸肽的富集方式將果蠅Kc167細胞系的磷酸肽的鑒定從299提高到494個，并且經(jīng)MS3質(zhì)譜譜圖的確認，提高了鑒定的可信度，也將磷酸化肽的鑒定數(shù)目提高到505個，其中25個蛋白（5%）都是這種新方法單獨鑒定的結(jié)果。這一嘗試使果蠅的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究有了巨大飛躍。另外通過將ETD和CID結(jié)合，進一步提高了果蠅Kc167細胞系磷酸化肽的鑒定率，其中ETD單獨鑒定了153個磷酸肽。這與提高磷酸肽富集效率的方法異曲同工，對果蠅修飾蛋白質(zhì)組的鑒定做出了巨大貢獻[24]。Courcelles等[25]發(fā)明了一種算法，可以鑒定磷酸肽的同分異構(gòu)體，在果蠅的磷酸化蛋白質(zhì)組鑒定中共得到15 700個磷酸肽，證明了在LC-MS的洗脫層面有8%～12%的磷酸肽都含有同分異構(gòu)體。

3.2 泛素化和類泛素化修飾

蛋白質(zhì)泛素化和類泛素化修飾對于蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解起著重要作用。隨著蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究的不斷深入，蛋白質(zhì)泛素化的新的功能不斷被挖掘，包括參與細胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、損傷修復(fù)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調(diào)控，并且在腫瘤、心血管等疾病發(fā)病中起十分重要的作用，是近年來生物化學(xué)研究的一項重大成果，亦是研究、開發(fā)新藥物的新靶點。Franco等[26]利用蛋白質(zhì)組學(xué)策略，在果蠅的胚胎細胞中鑒定到48個神經(jīng)細胞特異的泛素化底物。更為重要的是，這些泛素化底物都是首次被鑒定到，并且沒有任何同源的蛋白質(zhì)具有泛素化的證據(jù)，說明這種蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定的神經(jīng)細胞的泛素化底物并不與其他細胞類型共有。Nie等[27]在果蠅的早期胚胎細胞中鑒定到140個早期類泛素化底物，并且驗證了這些底物分別參與細胞周期調(diào)控、Ras信號通路和早期形體形成過程。類泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的產(chǎn)生，為以后研究類泛素化的功能提供了便利。Xu等[28]發(fā)展了一種果蠅近乎全標記的SILAC方法，并發(fā)現(xiàn)果蠅在成蟲期隨年齡的增長K48和K63泛素鏈具有不同的變化趨勢，表明蛋白質(zhì)的泛素化及其狀態(tài)和生物壽命相關(guān)。

3.3 組蛋白修飾

組蛋白上的翻譯后修飾主要有4種情況，即乙酰化、磷酸化、甲基化和ADP-核糖基化。甲基化和乙?；c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)，特別是組蛋白乙?；瘜τ诓溉閯游锷镧姷恼{(diào)控是非常重要的[29]。Ardehali等[30]通過多線染色體染色和活細胞成像技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)了一種位于啟動子區(qū)域的負責(zé)組蛋白H3K4三甲基化的蛋白dSet1。該蛋白依賴的H3K4三甲基化負責(zé)染色體結(jié)構(gòu)的形成，并保證RNA聚合酶Ⅱ的合成供給，進而完成對轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)。

Imhof等[31]發(fā)現(xiàn)組蛋白H1的修飾形式隨多細胞生物的不同生長階段而變化。以果蠅胚胎為例，S10期的H1單磷酸化豐度明顯比胚胎期的少，說明翻譯后修飾與細胞周期和細胞分化相關(guān)。這是首次在果蠅中進行組蛋白的翻譯后形式的鑒定，為后續(xù)研究提供了依據(jù)。

乙?；瘜虮磉_的調(diào)控已廣為人知。這一新的研究更讓人們確定組蛋白的乙?；瘜虮磉_的調(diào)控具有廣泛的作用[32]，而果蠅可以作為很好的模型來驗證這一論斷，進而推動組蛋白修飾在生命發(fā)展過程中發(fā)揮更加積極的作用。

4 果蠅比較蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)組具有動態(tài)、多樣和時空特異性。即使在細胞發(fā)育的不同階段，因不同時期、不同條件，蛋白質(zhì)組的構(gòu)成也不斷地變化。因此，分析比較不同條件下蛋白質(zhì)組的變化和差異，發(fā)現(xiàn)和鑒定在不同生理條件下蛋白質(zhì)組中的差異組分，從中揭示生命的奧秘，這些構(gòu)成了比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容。然而，比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究由于并不要求捕獲“全部”蛋白，而重在找出有意義的差異蛋白，因而在技術(shù)上有著相當(dāng)高的可實現(xiàn)性。目前常用的方法主要分為有標定量（labeling quantitation）和無標定量（la?bel-free quantitation）2類。有標定量又可分為化學(xué)標記方法［如同位素標記的親和標簽（isotope-cod?ed affinity tag，ICAT）、串聯(lián)質(zhì)譜標簽（tandem mass tag，TMT）、同位素相對標記與絕對定量技術(shù)（isobar?ic tagging for relative and absolute quantitation，iTRAQ）］和代謝標記方法［（細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）、15N代謝標記方法］[33]。目前果蠅中應(yīng)用較廣泛的有15N標記、SILAC、iTRAQ及無標定量方法。

4.1 15N標記方法

2003年Krijgsveld等[34]首次提出了果蠅全蛋白質(zhì)組的代謝標記策略。用只含15N的培養(yǎng)基標記酵母，再以此喂養(yǎng)生長在以這些標記酵母為惟一氮源的培養(yǎng)基中的果蠅卵，經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)15N的標記效率約為95%，證明果蠅可通過1個世代得到幾乎完全的標記。Findlay等[35]利用該技術(shù)研究了果蠅交配時精液蛋白對生殖的影響，發(fā)現(xiàn)了19個原先沒有注釋的基因。這種代謝標記和非標記果蠅可在蛋白樣品抽提前混合，因此可以極大地減少樣品操作過程引起的誤差。缺點是不同肽中標記的氮原子數(shù)目不同，致使標記與非標記肽的相對分子質(zhì)量位移在鑒定前不能預(yù)測，且標記肽段形成寬泛的同位素峰分布，增加了蛋白質(zhì)鑒定中的假陽性率和定量的難度。

4.2 SILAC標記方法

與15N標記方法不同，SILAC標記是利用重穩(wěn)定性同位素標記的氨基酸在生長過程中對目標蛋白質(zhì)組進行標記。這種標記和非標肽段的相對分子質(zhì)量位移是可以提前預(yù)測的，并且隨后的蛋白質(zhì)分離、酶切、鑒定等所有過程都在同一條件下進行，誤差小，重復(fù)性好，因此逐漸取代15N標記方法而成為現(xiàn)階段同位素代謝標記的金標準[37]。Bonaldi等[38]利用ISWI基因缺陷型果蠅模型和對照組的SILAC方法標記果蠅SL2細胞系，用LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀鑒定到4119個蛋白，同時得到了因ISWI基因表達水平的改變而引起的幾百個在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平表達產(chǎn)生顯著差異的蛋白。Sury等[39]報道，在果蠅中SILAC標記的效率可以達到近100%，為果蠅的SILAC標記提供了更廣闊的應(yīng)用空間。Xu等[28]也利用賴氨酸重標酵母的方法對果蠅進行了近乎完全的標記，并在果蠅的泛素化蛋白質(zhì)組研究中得到良好的應(yīng)用，為果蠅翻譯后修飾蛋白質(zhì)組的研究奠定了堅實基礎(chǔ)。

4.3 ICAT標記方法

ICAT是由Gygi等[40]開發(fā)的一種同位素親和標簽標記和定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略。該方法通過在蛋白水平分別加入不同標記的ICAT試劑，反應(yīng)后等比例混合進行消化和質(zhì)譜分析。實踐表明ICAT試劑存在一些不足，如不能分析半胱氨酸缺失的蛋白質(zhì)、標記和非標記肽不能被同步洗脫、難于精確定量等。另外，ICAT標簽試劑本身的相對分子質(zhì)量約為500，增加了譜圖和數(shù)據(jù)庫搜索的復(fù)雜性。為解決這些技術(shù)上的缺陷，先后又開發(fā)了可剪切ICAT（cleav?able ICAT，cICAT）試劑，用可被酸剪切的官能團代替ICAT試劑中的聚醚鏈接，以此減少難以解析的碎片離子數(shù)量；以9個13C取代8個氘原子，使輕、重同位素試劑相對分子質(zhì)量相差9，不僅便于質(zhì)譜分辨不同分子質(zhì)量的標簽，而且使得輕、重肽段可被色譜共洗脫，有效提高了定量精度。Kohler等[41]用cICAT標記方法檢測了普通幼蟲期果蠅和饑餓狀態(tài)下的脂肪體蛋白質(zhì)的表達變化，監(jiān)測到脂肪脫氫酶Desat1缺失時果蠅幼蟲細胞在喪失饑餓狀態(tài)下的自我吞噬的功能，首次揭示了Desat1在脂滴形成和自體吞噬中的作用。這種cICAT標記試劑的缺點是合成成本太高，難以普及使用。

4.4 iTRAQ標記方法

iTRAQ標記是化學(xué)標記的一種，可同時標記并比較8種不同樣本，提高了分析通量。Pflieger等[42]使用iTRAQ技術(shù)對蛋白磷酸酶處理后果蠅細胞系進行研究，通過比較蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)了胰島素受體的同源序列Chico。Pedersen等[43]為了檢測果蠅中的溫度敏感致死因子，采用iTRAQ技術(shù)對實驗組、近交系對照組和遠交系對照組進行不同的化學(xué)標簽標記，經(jīng)二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，共鑒定到45個在實驗組和近交系對照組發(fā)生了明顯變化的可能的溫度敏感蛋白，這些蛋白在近交系和遠交系對照組中并沒有發(fā)生顯著的量的變化，進一步證明了這些溫度敏感差異蛋白的真實性。但這種標記方法要求對比較的蛋白組必須進行提取、蛋白酶消化和脫鹽處理等多個步驟，然后才能進行標記、混合和質(zhì)譜鑒定、定量。這會引入試驗誤差，增加了發(fā)現(xiàn)真實的生物學(xué)差異蛋白的難度。

4.5 無標定量方法

無標定量方法不進行任何標記，而是直接利用質(zhì)譜鑒定中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，比如樣品酶切后經(jīng)LC-MS/MS產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對蛋白樣品進行定量比較。這種方法簡便易行，在果蠅定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究上也得到了廣泛應(yīng)用。Xun等[44]利用該方法分析了帕金森病果蠅模型的蛋白質(zhì)組，在A53T α-突觸核蛋白果蠅模型中鑒定、定量了253個蛋白，并在重疊區(qū)域篩選到24個表達差異蛋白。這些蛋白主要與膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌動蛋白細胞骨架、線粒體和核糖體相關(guān)。Xun等[45]將無標定量和廣泛型內(nèi)標技術(shù)相結(jié)合，定量了青少年型帕金森病果蠅模型（AR-JP），共定量了375個蛋白。其中16個蛋白具有顯著的表達差異，參與能量代謝的失調(diào)蛋白有7個，并有6個表達下調(diào)，說明青少年型帕金森病和能量代謝有較高的關(guān)聯(lián)性；參與蛋白轉(zhuǎn)運活動的5個蛋白均表現(xiàn)出較高的水平，如幼蟲血清蛋白1α、1β、1γ和脂肪體蛋白1均顯示出高于10倍的上調(diào)水平。盡管同位素標記已成為可信賴的定量方法，但準備同位素化合物需大量時間，并且試劑昂貴，難以推廣，而非標定量法不存在這些缺點，應(yīng)用前景廣闊。但非標定量法對樣品制備和分析過程的控制要求較高，否則難以得到可信的結(jié)果。

5 果蠅疾病模型蛋白質(zhì)組

近一個世紀以來，果蠅作為生命科學(xué)領(lǐng)域的一種理想的模式生物，在生物學(xué)研究的舞臺上占有舉足輕重的地位。十幾年前完成的果蠅的基因組測序結(jié)果顯示，超過60%的人類疾病基因在果蠅的基因組中有直系同源物，其中人類的腫瘤、神經(jīng)疾病、畸形綜合征等相關(guān)基因多與果蠅基因同源。因此，以果蠅為模式研究人類疾病的發(fā)病機制有非常重要的意義[46]。

Xun等[47]利用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對A30P α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因果蠅和對照的早期帕金森病果蠅模型進行了蛋白質(zhì)組研究，結(jié)果顯示約44%的基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均發(fā)生了改變，但變化趨勢不完全一致。蛋白質(zhì)組研究彌補了轉(zhuǎn)錄本研究的不足，對后期疾病狀態(tài)的預(yù)測有較大的幫助。他們在該研究中還發(fā)現(xiàn)，早期的細胞骨架和線粒體差異蛋白主要與神經(jīng)退化相關(guān)。

Beller等[49]比較了野生型和脂肪儲存缺陷型果蠅的脂肪滴成分的差異，在鑒定到的248個蛋白中，除了發(fā)現(xiàn)與脂肪滴相關(guān)的PAT蛋白外，還鑒定了參與蛋白質(zhì)胞內(nèi)定位和多層面轉(zhuǎn)運的一些相關(guān)蛋白。Li等[50]利用2-DE技術(shù)研究了經(jīng)飲食抑制劑BBI處理后果蠅胚胎中腸蛋白質(zhì)組的變化，發(fā)現(xiàn)了9種表達差異蛋白，例如固醇載體蛋白SCPX參與了脂肪酸代謝過程。脂滴和脂肪酸代謝直接介導(dǎo)肝臟脂質(zhì)代謝，是肝病發(fā)生和發(fā)展的主要成因，這為人類肝臟疾病的研究提供了依據(jù)。

Chan等[51]利用果蠅模型研究了VCP基因引起的額顳葉癡呆?。↖BMPFD）的比較蛋白質(zhì)組。利用2D-DIGE方法在轉(zhuǎn)基因果蠅模型中鑒定了43個蛋白點，并發(fā)現(xiàn)VCP的突變消耗了大量ATP，為節(jié)約能量，導(dǎo)致肌動蛋白關(guān)閉，由此激活ROS信號通路，進而引發(fā)細胞凋亡。這是蛋白質(zhì)組學(xué)在探索IBMPFD分子機制方面的新發(fā)現(xiàn)，為發(fā)病機理的研究和治療靶點的尋找提供了有力證據(jù)。

6 結(jié)語

利用果蠅進行遺傳學(xué)研究的歷史悠久，對其染色體組成、編碼基因、蛋白質(zhì)定位和表型等的詳細闡明都是其他生物無法比擬的。百余年的研究也積累了很多果蠅的相關(guān)知識與信息，制備了大量分布于數(shù)以千計的基因中的突變體，為構(gòu)建果蠅的各種疾病模型奠定了基礎(chǔ)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，果蠅還將繼續(xù)作為重要的模式生物被廣泛用于生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域。這為開展與疾病相關(guān)的臨床蛋白質(zhì)組學(xué)（clinical proteomics）研究，揭示生命的奧秘和疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定堅實的基礎(chǔ)。

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