鼻腔滴入胰島素改善2型糖尿病大鼠海馬阿爾茨海默病樣改變*

楊 雁， 馬德琳， 王玉萍， 姜 騰， 胡蜀紅， 余學(xué)鋒

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 武漢 430030)

鼻腔滴入胰島素改善2型糖尿病大鼠海馬阿爾茨海默病樣改變*

楊 雁， 馬德琳， 王玉萍， 姜 騰， 胡蜀紅， 余學(xué)鋒△

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 武漢 430030)

目的2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)時(shí)大腦出現(xiàn)胰島素水平下降及胰島素信號(hào)通路下調(diào)，使大腦海馬tau蛋白出現(xiàn)過(guò)度磷酸化的阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)樣改變。本研究選取2型糖尿病大鼠，皮下注射及鼻腔滴入胰島素，觀(guān)察大腦AD樣病變的改變，并探討其機(jī)制。方法高糖、高脂、高蛋白喂飼3個(gè)月后鏈脲佐菌素腹腔注射制備T2D大鼠模型。運(yùn)用2種方法干預(yù)：鼻腔滴入胰島素(T2D+I-I)及皮下注射胰島素(T2D+S-I)。檢測(cè)血漿葡萄糖、血漿胰島素和腦脊液胰島素水平，免疫印記方法檢測(cè)大腦海馬總tau蛋白和tau蛋白部分位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵酶磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt及糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)活性。結(jié)果T2D組大鼠血漿葡萄糖及胰島素水平顯著升高，腦脊液胰島素水平顯著降低，大腦海馬組織中tau蛋白呈過(guò)度磷酸化狀態(tài)，PI3K/Akt活性下降， GSK-3β磷酸化水平升高； T2D+I-I組大鼠血漿胰島素及葡萄糖水平無(wú)顯著改變，但大腦海馬tau蛋白過(guò)度磷酸化狀態(tài)顯著好轉(zhuǎn)，PI3K/Akt活性顯著升高，GSK-3β活性顯著下降； T2D+S-I組大鼠血糖顯著下降，但血漿及腦脊液胰島素水平無(wú)顯著改變，大腦海馬tau蛋白磷酸化水平有輕度改善，但變化不顯著。結(jié)論運(yùn)用鼻腔滴入胰島素可減輕T2D時(shí)大腦海馬組織的AD樣病變；外周皮下胰島素注射對(duì)T2D時(shí)AD樣病變無(wú)明顯作用。

阿爾茨海默??； 2型糖尿??； 胰島素； Tau蛋白過(guò)度磷酸化； 胰島素信號(hào)途徑

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝病。阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，占成人癡呆癥的60%[1]。隨著人們生活方式的改變(能量攝入增加和運(yùn)動(dòng)減少等)及人口老齡化，T2D及AD患者人數(shù)急劇上升。流行病學(xué)資料顯示，T2D人群較非T2D人群發(fā)生AD的風(fēng)險(xiǎn)要上升1.5～2.5倍[2-3]。因此，探討T2D時(shí)導(dǎo)致AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高的原因并尋求有效的治療藥物具有重要臨床意義。

AD最早出現(xiàn)的典型病理生理改變是大腦海馬組織中tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)和淀粉樣β肽(amyloid β-peptide, Aβ)聚集形成老年斑，其中tau蛋白過(guò)度磷酸化由于先于Aβ聚集出現(xiàn)，被稱(chēng)為AD樣(AD-like)改變[4]。有研究發(fā)現(xiàn)在8周齡的糖尿病模型db/db小鼠中，大腦海馬tau蛋白已呈過(guò)度磷酸化的AD樣改變，并且這種改變隨著小鼠周齡的增長(zhǎng)而逐漸加重[5]。Tau蛋白磷酸化狀態(tài)受蛋白激酶與蛋白磷酸酶的雙重調(diào)節(jié)，其中糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)是tau蛋白的重要磷酸激酶，其活性上升可導(dǎo)致tau蛋白上大多數(shù)位點(diǎn)發(fā)生過(guò)度磷酸化改變[5-6]。

T2D特征性表現(xiàn)為高胰島素血癥、外周組織胰島素抵抗和血葡萄糖產(chǎn)生增加。我們前期的研究及國(guó)外的研究證實(shí)： (1)T2D時(shí)，大腦組織呈AD樣病變[7]；(2)大腦海馬細(xì)胞內(nèi)GSK-3β活性上升，導(dǎo)致大腦海馬內(nèi)tau蛋白出現(xiàn)過(guò)度磷酸化，促進(jìn)AD的發(fā)生[8]；(3)T2D時(shí)，雖然外周胰島素水平顯著升高，但大腦胰島素水平卻沒(méi)有升高，反而出現(xiàn)下降，這可能與血腦屏障對(duì)胰島素的轉(zhuǎn)運(yùn)下降有關(guān)[9-10]；(4)T2D時(shí)，大腦胰島素信號(hào)途徑中重要組成部分磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt活性下降，從而導(dǎo)致其下游即tau蛋白磷酸激酶GSK-3β活性反饋性增高[11-12]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大腦胰島素水平的下降和胰島素信號(hào)途徑的激活減弱是導(dǎo)致T2D時(shí)AD形成的重要因素之一，因此，改善下降的大腦胰島素水平及增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路可能是減少T2D時(shí)AD發(fā)病的重要靶點(diǎn)之一。

本研究選取2型糖尿病大鼠，通過(guò)皮下注射胰島素或鼻腔滴入胰島素2種方式改善大腦胰島素水平，通過(guò)檢測(cè)干預(yù)前后大腦海馬tau蛋白磷酸化水平及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中各酶活性，來(lái)探討T2D時(shí)大腦胰島素水平異常作為AD發(fā)病重要風(fēng)險(xiǎn)因素的原因。本研究將對(duì)降低T2D患者AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的治療有重要意義。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物模型

1.1T2D大鼠模型的制備 雄性SD大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)54只，體重150～180 g，10～12周齡，其中隨機(jī)42只給予高脂高糖高蛋白飲食[熱卡百分比為碳水化合物26%，蛋白質(zhì)15.2%，脂肪(煉豬油)58.8%] 3個(gè)月，按照30～35 mg/kg劑量尾靜脈一次性注射STZ(Sigma，粉劑溶于0.1 mol/L pH 4.3檸檬酸鈉緩沖液中)，72 h后尾靜脈取血，血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)豪)測(cè)血糖≥16.7 mmol/L、尿糖持續(xù)陽(yáng)性為造模成功，42只高脂高糖高蛋白飲食+STZ小劑量注射大鼠中，36只血糖高于入選標(biāo)準(zhǔn)，納入2型糖尿病組(T2D組)。另外12只給予普通飲食喂養(yǎng)，并按照上述方法尾靜脈注射檸檬酸緩沖液(CTL組)。

1.2T2D大鼠胰島素干預(yù) 隨機(jī)將36只T2D大鼠分為3組，均繼續(xù)高脂高糖高蛋白飲食，11只給予皮下胰島素注射(subcutaneous insulin injection，S-I)，劑量為0.1 U/kg(T2D+S-I,n=11)，每天1次。12只給予鼻腔滴入胰島素(intranasal insulin treatment，T2D+I-I,n=12)，按照Dhuria等[13]的方法，麻醉大鼠，取仰臥位，將大鼠頭部與身體角度處于70～90度，將胰島素通過(guò)移液器送入鼻腔，胰島素濃度為4×104U/L，每次每只大鼠用量1 U,即25 μL， 5 μL交替滴鼻，共滴5次，每次間隔1 min，每天給藥1次。T2D+S-I組及T2D+I-I組均空腹過(guò)夜， 8:00 AM給予胰島素后即可進(jìn)食。胰島素種類(lèi)均使用短效胰島素(諾和靈R，諾和諾德天津制藥有限公司)。未經(jīng)胰島素干預(yù)的T2D組大鼠(n=13)給予25 μL生理鹽水滴鼻，每次5 μL，共滴5次，每次間隔1 min。干預(yù)4周以后，與進(jìn)食普通飼料的CTL大鼠同時(shí)斷頸處死。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠單籠飼養(yǎng)于恒溫(25 ℃)的清潔級(jí)動(dòng)物房中，每天光照12 h，T2D組、T2D+I-I組及T2D+S-I組給予胰島素或生理鹽水干預(yù)后投食，CTL組大鼠可自由進(jìn)食。各組大鼠自由飲水，除胰島素干預(yù)外未經(jīng)任何降糖藥物處理。

2觀(guān)察指標(biāo)及方法

2.1一般指標(biāo)

2.1.1血糖(plasma glucose) 處死前由尾靜脈采血，用血糖儀檢測(cè)血糖水平。

2.1.2血漿胰島素(plasma insulin) 處死前心臟取血1mL，離心后取血漿，-20℃保存，放免法1次性檢測(cè)。試劑盒購(gòu)自北京原子能研究所， 測(cè)定值批內(nèi)CV<2.5%，批間CV<3.5%。

2.1.3胰島素抵抗指標(biāo) 以穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resis-tance,HOMA-IR)表示,HOMA-IR=FINS(fasting insulin, U/L)×FPG (fasting plasma glucose, mmol/L)/22.5。

2.1.4腦脊液胰島素 (cerebrospinal fluid insulin，CSF insulin) 參照Hoistad等[14]的方法，運(yùn)用20%烏拉坦將大鼠麻醉以后，剪開(kāi)頭部皮膚，清理組織和肌肉，暴露小腦及延髓部，運(yùn)用注射器針頭在腦膜上開(kāi)孔，向內(nèi)插入細(xì)管，將細(xì)管末端低于頭部，等待腦脊液自動(dòng)流出，收集20～50 μL以檢測(cè)腦脊液胰島素水平。

2.2蛋白質(zhì)印跡方法分析各組大鼠大腦海馬組織內(nèi)總tau蛋白和tau蛋白部分位點(diǎn)的磷酸化水平,胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中總Akt、磷酸化Akt、總GSK-3β及磷酸化GSK-3β的水平 處死動(dòng)物，取出一側(cè)大腦海馬組織。一部分放入勻漿器內(nèi)，加入蛋白質(zhì)提取液，冰上勻漿。蛋白質(zhì)提取液:40 mmol/L Tris-HCl， pH 7.0，1% Triton X-100，0.2% SDS，1.0 mmol/L脫氧膽酸鈉，1.0 mmol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF， 1.0 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)，2.0 mg/L抑肽酶(aprotinin)、 亮抑蛋白酶肽(leupeptin)和抑肽素(pepstatin)，1.0 mmol/L EGTA,1.0 mmol/L EDTA(以上試劑購(gòu)自武漢凌飛科技公司)。于4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清即為蛋白質(zhì)。取10 μL用Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，余儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。用前?×樣本緩沖液并混勻，于100 ℃變性5 min。每孔內(nèi)加入約12 μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳，結(jié)束后全濕轉(zhuǎn)至NC膜。搖床上5%BSA封閉2 h；雜交Ⅰ抗(所有抗體如表1所示)4 ℃過(guò)夜；PBST洗膜3次，每次10 min；雜交Ⅱ抗(辣根酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠及兔抗羊IgG購(gòu)自Pierce)，室溫?fù)u床上1 h；PBST洗膜3次，每次10 min； ECL顯色，最后用膠片感光。運(yùn)用BandScan 5.0軟件對(duì)免疫反應(yīng)條帶進(jìn)行定量分析。

表1 研究所用Ⅰ抗

p-tau: phosphorylated tau; NP-tau: non-phosphorylated tau.

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Prism 4.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有顯著意義。

結(jié) 果

1各組大鼠血糖、血漿胰島素、腦脊液胰島素水平及胰島素抵抗程度的比較

T2D組血糖水平及血漿胰島素水平顯著高于CTL組，但腦脊液胰島素水平顯著低于CTL組。T2D+S-I組大鼠血糖水平較T2D組顯著降低，血漿胰島素水平較T2D組顯著增高，但腦脊液中胰島素水平無(wú)顯著變化。T2D+I-I組大鼠血糖水平及血漿胰島素水平與T2D組比較無(wú)顯著改變，但腦脊液胰島素水平較T2D組顯著增高，并與CTL組相比無(wú)顯著差異。運(yùn)用HOMA-IR公式評(píng)估的胰島素抵抗程度結(jié)果顯示，T2D組胰島素抵抗程度顯著高于CTL組，經(jīng)胰島素干預(yù)的2組大鼠外周胰島素抵抗程度與T2D組比較無(wú)顯著差異，表明2種胰島素干預(yù)措施均不能改善T2D的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),見(jiàn)表2。

2免疫印跡方法檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)總tau蛋白和tau蛋白磷酸化水平

如圖1所示，T2D組及經(jīng)胰島素干預(yù)后的T2D+S-I組和T2D+I-I組大腦海馬總tau蛋白與CTL組比較無(wú)顯著差異。此結(jié)果說(shuō)明，外周的高胰島素血癥、高血糖癥及腦脊液中的胰島素缺乏均對(duì)總tau蛋白無(wú)影響，并且運(yùn)用胰島素干預(yù)后總tau蛋白亦無(wú)顯著改變。

表2 各組大鼠的體重和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)

*P<0.05,**P<0.01vsCTL;#P<0.05,##P<0.01vsT2D.

選擇tau蛋白的磷酸化位點(diǎn)Ser199、Ser202及Ser396，通過(guò)檢查其磷酸化程度來(lái)說(shuō)明tau蛋白磷酸化水平。 如圖1所示，T2D組大鼠大腦海馬tau蛋白在以上3個(gè)位點(diǎn)均呈過(guò)度磷酸化表現(xiàn)，在Ser199和Ser202這2個(gè)位點(diǎn)的非磷酸化水平較CTL組顯著下降； T2D+S-I組tau蛋白在Ser199/202位點(diǎn)上磷酸化程度較T2D組有減輕，但不顯著，這2個(gè)位點(diǎn)的非磷酸化水平與T2D組相比無(wú)顯著差異,而Ser396位點(diǎn)的磷酸化水平較T2D組明顯減低；運(yùn)用鼻腔滴入胰島素干預(yù)后tau蛋白在Ser199/202及Ser396位點(diǎn)上過(guò)度磷酸化程度較T2D組顯著減輕,Ser199/202位點(diǎn)的非磷酸化水平較T2D組顯著升高。

Figure 1. Western blotting analysis of total tau level and phosphorylation of tau.Mean±SD.*P<0.05vsCTL;#P<0.05vsT2D.

圖1免疫印跡技術(shù)檢測(cè)大鼠大腦海馬總tau蛋白及tau蛋白部分位點(diǎn)的磷酸化水平

3免疫印跡方法檢測(cè)大鼠大腦海馬內(nèi)胰島素信號(hào)途徑中PI3K/Akt/GSK-3β的活性

胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中PI3K活性通過(guò)其下游Akt活性來(lái)評(píng)估，當(dāng)磷酸化Akt/總Akt比例越高，則Akt活性越高,即表示PI3K活性越高；而GSK-3β位于PI3K/Akt下游，其活性受Akt抑制，本研究選取磷酸化GSK-3β(Ser9)與總GSK-3β的比值來(lái)評(píng)估GSK-3β活性，比值越大，則GSK-3β活性越低。

如圖2所示，各組總Akt水平無(wú)顯著異常，T2D組大鼠大腦海馬磷酸化Akt水平下降，T2D+S-I組中Akt磷酸化程度與T2D比較無(wú)顯著改變，但T2D+S-I組Akt的磷酸化程度有上升；各組總GSK-3β水平無(wú)顯著改變，T2D組大鼠大腦海馬磷酸化GSK-3β水平下降，T2D+S-I組及T2D+I-I組GSK-3β的磷酸化程度均有所有上升，其中，T2D+I-I組GSK-3β磷酸化程度較T2D組上升更明顯。

討 論

Tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD最早出現(xiàn)的病理生理改變之一，其出現(xiàn)要遠(yuǎn)早于AD的臨床癥狀出現(xiàn)，因此被稱(chēng)為AD樣改變。Tau蛋白上大部分位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化改變均與GSK-3β活性有關(guān)，GSK-3β活性增高可導(dǎo)致tau蛋白上大多數(shù)位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化改變[11, 15-17]；除此之外，GSK-3β位于胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，當(dāng)胰島素抵抗形成或胰島素絕對(duì)缺乏，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下降，位于PI3K下游的GSK-3β活性上升[11]。

前期研究證實(shí)，2型糖尿病大鼠大腦胰島素缺乏，導(dǎo)致大腦胰島素信號(hào)途徑下調(diào)，位于胰島素信號(hào)途徑中位于PI3K/Akt下游的G3K-3β活性升高，最終導(dǎo)致海馬組織tau蛋白出現(xiàn)AD樣病變。Lee等[18]的研究顯示，在對(duì)高分化海馬神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入胰島素，可導(dǎo)致Aβ沉積下降；對(duì)AD小鼠海馬定位注射胰島素，可顯著改善其認(rèn)知功能。這些研究資料提示，AD大腦中由于低胰島素水平導(dǎo)致的AD樣病變可以通過(guò)注射胰島素得到改善。有研究顯示，外周胰島素?zé)o法自由通過(guò)血腦屏障，但鼻腔滴入胰島素可直接增加腦脊液胰島素水平[19]。因此，本研究采用2種方法改善大腦胰島素缺乏狀態(tài)，旨在恢復(fù)大腦胰島素信號(hào)途徑，降低AD病變的發(fā)生。結(jié)果顯示，運(yùn)用外周胰島素注射，可降低血漿血糖，但對(duì)血漿胰島素水平、腦脊液胰島素?zé)o影響，tau蛋白的過(guò)度磷酸化無(wú)顯著改變；運(yùn)用鼻腔滴入胰島素后對(duì)血漿血糖、血漿胰島素?zé)o顯著影響，但增高了大腦胰島素水平，tau蛋白過(guò)度磷酸化狀態(tài)得到改善。

Figure 2. Western blotting analysis of Akt, GSK-3β and their phosphorylation.Mean±SD.*P<0.05vsCTL;#P<0.05vsT2D.

圖2免疫印跡方法檢測(cè)大腦胰島素信號(hào)途徑中Akt及GSK-3β活性

為了進(jìn)一步探討鼻腔滴入胰島素治療對(duì)tau蛋白磷酸化狀態(tài)影響的機(jī)制，本研究檢測(cè)了大腦胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵酶PI3K/Akt及下游GSK-3β活性，結(jié)果表明，鼻腔滴入胰島素導(dǎo)致大腦胰島素水平增高后，可顯著改善胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，表現(xiàn)為PI3K/Akt活性增高，其下游的GSK-3β活性受抑，tau蛋白過(guò)度磷酸化逆轉(zhuǎn)，從而改善大腦AD樣改變。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)T2D大鼠大腦呈AD樣改變，與大鼠大腦內(nèi)胰島素水平降低、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵酶活性下調(diào)密切相關(guān)。外周給予T2D大鼠胰島素注射不能直接通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，因此不能升高大腦胰島素水平，tau蛋白AD樣病變改善不明顯，但鼻腔滴入胰島素可直接升高腦脊液胰島素水平，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑恢復(fù)，AD樣病變可得到改善。本研究為T(mén)2D導(dǎo)致 AD發(fā)病的原因提供理論依據(jù)，并為T(mén)2D時(shí)降低AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供治療途徑依據(jù)。

[1] Stranahan AM,Mattson MP. Metabolic reserve as a determinant of cognitive aging[J]. J Alzheimers Dis, 2012, 30(Suppl 2): S5-S13.

[2] Ott A, Stolk RP, van Harskamp F, et al. Diabetes mellitus and the risk of dementia: the Rotterdam Study[J]. Neurology, 1999, 53(9): 1937-1942.

[3] Schrijvers EM, Witteman JC, Sijbrands EJ, et al. Insulin metabolism and the risk of Alzheimer disease: the Rotterdam Study[J]. Neurology, 2010, 75(22): 1982-1987.

[4] Iqbal K, Liu F, Gong CX, et al. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies[J]. Curr Alzheimer Res, 2010, 7(8): 656-664.

[5] Kim B, Backus C, Oh S, et al. Increased tau phosphorylation and cleavage in mouse models of type 1 and type 2 diabetes[J]. Endocrinology, 2009, 150(12): 5294-5301.

[6] Liu Y, Liu F, Grundke-Iqbal I, et al. Brain glucose transporters,O-GlcNAcylation and phosphorylation of tau in diabetes and Alzheimer’s disease[J]. J Neurochem, 2009, 111(1): 242-249.

[7] Qu Z, Jiao Z, Sun X, et al. Effects of streptozotocin-induced diabetes on tau phosphorylation in the rat brain[J]. Brain Res, 2011, 1383: 300-306.

[8] 楊 雁，胡蜀紅，張建華，等. 肥胖及2型糖尿病大鼠Alzheimer病樣Tau蛋白過(guò)度磷酸化修飾及機(jī)制探討[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006，33(5):458-464.

[9] McNay EC,Recknagel AK. Brain insulin signaling: a key component of cognitive processes and a potential basis for cognitive impairment in type 2 diabetes[J]. Neurobiol Learn Mem, 2011, 96(3): 432-442.

[10]Holscher C. Diabetes as a risk factor for Alzheimer’s disease: insulin signalling impairment in the brain as an alternative model of Alzheimer’s disease[J]. Biochem Soc Trans, 2011, 39(4): 891-897.

[11]Jolivalt CG, Lee CA, Beiswenger KK, et al. Defective insulin signaling pathway and increased glycogen synthase kinase-3 activity in the brain of diabetic mice: parallels with Alzheimer’s disease and correction by insulin[J]. J Neurosci Res, 2008, 86(15): 3265-3274.

[12]楊 雁，王玉萍，謝君輝，等. 大腦胰島素信號(hào)途徑受損導(dǎo)致2型糖尿病時(shí)阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012，28(5):449-454.

[13]Dhuria SV, Hanson LR, Frey WH 2nd. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations[J]. J Pharm Sci, 2010, 99(4): 1654-1673.

[14]Hoistad M, Samskog J, Jacobsen KX, et al. Detection of β-endorphin in the cerebrospinal fluid after intrastriatal microinjection into the rat brain[J]. Brain Res, 2005, 1041(2): 167-180.

[15]Gong CX, Liu F, Grundke-Iqbal I, et al. Post-translational modifications of tau protein in Alzheimer’s disease[J]. J Neural Transm, 2005, 112(6): 813-838.

[16]魏 偉，陸大祥，戚仁斌. 葉酸和維生素B12減輕高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的老年大鼠阿爾茨海默樣病變[J].中國(guó)病理生理雜志,2012,28(8):1436-1440.

[17]徐柯樂(lè)，陳 勤，劉 偉,等.遠(yuǎn)志皂苷減輕Aβ1-40誘導(dǎo)的AD大鼠腦神經(jīng)元tau蛋白Ser396位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化[J].中國(guó)病理生理雜志,2012,28(9):1605-1609.

[18]Lee HK, Kumar P, Fu Q, et al. The insulin/Akt signaling pathway is targeted by intracellular β-amyloid[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20(5): 1533-1544.

[19]Reger MA, Watson GS, Green PS, et al. Intranasal insulin improves cognition and modulates β-amyloid in early AD[J]. Neurology, 2008, 70(6): 440-448.

IntranasalinsulintreatmentamelioratesAlzheimerdisease-likechangesinhippocampusinaratmodeloftype2diabetes

YANG Yan, MA De-lin, WANG Yu-ping, JIANG Teng, HU Shu-hong, YU Xue-feng

(DepartmentofEndocrinology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:xfyu188@163.com)

AIM: To investigate Alzheimer disease (AD)-like changes and 2 key components of the insulin signaling pathway in the brain of a rat model of type 2 diabetes (T2D) after insulin treatment.METHODSThe rat model of T2D was established by feeding a high-protein, high-glucose and high-fat diet followed by intrasubcutaneous injection of streptozocin. Intranasal insulin treatment (T2D+I-I) and subcutaneous insulin injection (T2D+S-I) were applied to elevate the insulin level in the brain. The insulin levels in plasma and cerebrospinal fluid as well as the concentration of plasma glucose were measured. Total tau level, the phosphorylation level of tau at some phosphorylation sites, and the activation of GSK-3β and Akt in subcutaneous of the rats were also analyzed by Western blotting.RESULTSAD-like changes, decreased Akt activation and over-activation of GSK-3β in the hippocampus of the T2D rats were observed. Intranasal insulin treatment for 4 weeks normalized the levels of Akt and GSK-3β, as well as reduced the AD-like changes in the hippocampus of the T2D rats, whereas the treatment with insulin by subcutaneous injection for 4 weeks had minimal effects on the levels of GSK-3β and tau phosphorylation in the hippocampus.CONCLUSIONIntranasal insulin treatment, but not subcutaneous insulin treatment, might decrease the risk of AD in T2D rats by reducing AD-like changes and up-regulating the impaired insulin signaling pathway in the hippocampus,indicating the potential use of intranasal insulin delivery for treatment of AD.

Alzheimer disease; Type 2 diabetes; Insulin; Tau hyperphosphorylation; Insulin signaling pathway

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.009

1000- 4718(2013)01- 0056- 06

2012- 06- 25

2012- 11- 19

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.81100582)；教育部博士點(diǎn)新教師基金資助項(xiàng)目(No.200804871047)；湖北省衛(wèi)生廳一般項(xiàng)目(No.JX5B04)

△通訊作者 Tel： 027-83662883；E-mail： xfyu188@163.com