高血壓病患者基質(zhì)金屬蛋白酶3基因多態(tài)性與左室重構(gòu)的關(guān)系*

邵也常， 鄧木蘭， 符永恒， 許 燕， 石美玲

左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是左心室對(duì)各種機(jī)械和激素刺激產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，其中以高血壓誘導(dǎo)的LVH為主，是心血管疾病發(fā)病和死亡增加的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因子，也是左心室重構(gòu)發(fā)生的基礎(chǔ)，最終將導(dǎo)致充血性心力衰竭［1］。高血壓誘導(dǎo)LVH的具體機(jī)制目前尚未被完全闡明，細(xì)胞外基質(zhì)定性和定量的改變對(duì)心肌細(xì)胞排列、心肌幾何學(xué)構(gòu)型的影響可能是關(guān)鍵因素。而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一組能特異降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的Zn2+依賴的酶，在組織重構(gòu)中起重要作用，作為MMPs家族激活共同途徑的MMP-3通過(guò)膠原降解及激活其它MMPs直接參與了心肌的重構(gòu)，目前發(fā)現(xiàn)MMP-3存在基因多態(tài)性，其不同基因型對(duì)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著不同的影響，其對(duì)左室重構(gòu)的作用如何，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究就高血壓病患者M(jìn)MP-3基因多態(tài)性對(duì)血清MMP-3的表達(dá)與左室重構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行了分析和探討。

材料和方法

1 臨床資料

入選標(biāo)準(zhǔn):按照《中國(guó)高血壓防治指南》標(biāo)準(zhǔn)確診的高血壓病患者，簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):惡性腫瘤、骨關(guān)節(jié)疾病、肝腎功能障礙、懷孕、嚴(yán)重精神疾病患者。共入選190名高血壓病患者，男性107人，女性83人，平均年齡(57.25±7.03)歲。所有患者均自愿入組，對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意，本研究?jī)?nèi)容經(jīng)廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)要求。

2 主要方法

2.1 血清MMP-3檢測(cè) 血液標(biāo)本采集:早晨空腹抽靜脈血各2試管，一管EDTA-Na2抗凝，用于DNA抽提;另一管不加抗凝劑，高速離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，分離血清，用于MMP-3含量檢測(cè)。血清MMP-3水平應(yīng)用ELISA試劑盒，美國(guó)BIO-REK多通道酶標(biāo)儀(型號(hào):SYNERGY TM HT)進(jìn)行檢測(cè)。2.2 MMP-3基因多態(tài)性檢測(cè)

2.2.1 DNA提取 應(yīng)用天根公司的血液基因組提取試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。

2.2.2 PCR擴(kuò)增 用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，目標(biāo)基因是MMP-3基因啟動(dòng)子序列。上游引物 5’-CCACCACTCTGTTCTC-3’，下游引物 5’-CCCTATGACTGAAGATGC-3’，由英韋創(chuàng)津公司合成引物。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):10 × 緩沖液 2.5 μL，4 × dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL ，上、下游引物各 1 μL，rTaq DNA 酶0.15 μL，DNA 模板2 μL，然后加雙蒸水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min。取PCR產(chǎn)物3 μL進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，120 V電泳30 min。然后用0.005%溴化乙啶染色。紫外燈下觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

2.3 心臟多普勒超聲檢測(cè) 患者取左側(cè)臥位，于胸骨左緣長(zhǎng)軸面按美國(guó)超聲心動(dòng)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定舒張末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LPWT)、室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd)和左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-sysytolic diameter，LVEDs)，連續(xù)測(cè)定3個(gè)心動(dòng)周期取平均值。有關(guān)計(jì)算公式:體重指數(shù)(body mass index，BMI)=weight/height2;體表面積(body surface area，BSA)=0.0061 ×height(cm)+0.0128×weight(kg)－0.1529;左室重量(left ventricular mass，LVM)=0.8 ×［1.04 × (IVST+LVEDd+LPWT)3-LVEDd3］+0.6;左室重量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI，g/m2)=LVM/BSA(其中IVST、LVEDd和LPWT單位是cm)。左室肥厚診斷標(biāo)準(zhǔn):LPWT≥12 mm 和(或)LVMI男≥130 g/m2，女≥120 g/m2。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布或方差不齊者采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析;多組資料比較采用方差分析?；蛐图暗任换蝾l率采用以下公式計(jì)算:等位基因頻率=1/2(純合子×2+雜合子)/被檢人數(shù)。組間基因型及等位基因頻率比較采用卡方檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 基本情況

本組高血壓患者伴有左室肥厚者108人，無(wú)左室肥厚者82人。MMP-3基因型測(cè)序結(jié)果6A純合子128例，5A純合子9例，5A/6A雜合子53例。

2 心臟B超結(jié)果

5A基因型左室重量和左室重量指數(shù)都要大于6A基因型，差異顯著，室間隔厚度和左室后壁厚度5A基因型也比6A基因型稍大，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。攜帶5A基因的高血壓患者比攜帶6A基因的高血壓患者似乎更容易發(fā)生左室肥厚，差異顯著，OR=2.05，見(jiàn)表 2。

3 基因型與血清MMP-3水平

5A基因型MMP-3水平要比6A基因型高，分別為5A 基因型(145.35 ±83.29)μg/L、5A/6A 基因型(132.26 ±81.29)μg/L 和 6A 基因型(108.23 ±45.61)μg/L，但各組之間差異無(wú)顯著。

4 MMP-3血清水平與心臟B超

MMP-3血清水平與心臟B超測(cè)量指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析顯示，MMP-3血清水平與室間隔厚度、左室后壁厚度、左室重量和左室重量指數(shù)均呈正相關(guān)(P＜0.01)。

討 論

Figure 1.The results of MMP-3 DNA sequencing.Arrows indicate the location of 5A/6A polymorphism in the promoter of MMP-3 gene.A:6A/6A genotype;B:5A/6A genotype;C:5A/5A genotype.圖1 MMP-3基因啟動(dòng)子測(cè)序結(jié)果

表1 不同基因型高血壓患者心臟B超測(cè)量指標(biāo)Table 1.The echocardiography indicators of the heart in hypertensive patients with different genotypes(Mean±SD)

左心室重構(gòu)是心臟對(duì)高血壓介導(dǎo)的壓力超負(fù)荷的早期代償性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)異常。環(huán)境刺激和組織損傷后，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在數(shù)量、組成及空間結(jié)構(gòu)上發(fā)生改變，以維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，因此ECM在維持心臟結(jié)構(gòu)和功能的完整性中發(fā)揮著重要作用［2］。ECM主要由3種成分組成:(1)纖維狀蛋白，主要為Ⅰ、III型膠原和彈力蛋白;(2)蛋白聚糖;(3)基底膜蛋白，主要為Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白。ECM中來(lái)自于成纖維細(xì)胞的Ⅰ、III型膠原與心臟結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。心肌ECM中Ⅰ型膠原、III型膠原占優(yōu)勢(shì)。前者具有高度牽引力和硬度，而后者具有彈性。在高血壓心臟病患者的心肌組織中Ⅰ型膠原明顯增加，Ⅰ型膠原/III型膠原明顯上升，組織僵硬且順應(yīng)性減低［3］。ECM形成的細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)為心肌細(xì)胞提供機(jī)械支持，保持其排列次序，對(duì)于心肌組織的完整性和連貫性至關(guān)重要，特別是當(dāng)其肥大和增生的時(shí)候。動(dòng)物和人體模型的研究都報(bào)道心肌層膠原結(jié)構(gòu)和組分的變更能夠?qū)ψ笮氖倚螒B(tài)和功能產(chǎn)生漸進(jìn)性影響。心肌膠原基質(zhì)可維持心肌細(xì)胞及心肌纖維的排列、限制心肌細(xì)胞過(guò)度拉長(zhǎng)。心肌基質(zhì)的改變還可造成心肌收縮和有效射血之間失去協(xié)調(diào)性，并且對(duì)維持左室的幾何形狀有明顯的支持作用，減輕泵功能受損。左室泵功能下降早期伴隨左室擴(kuò)大、室壁變薄及心肌細(xì)胞拉長(zhǎng)，其中一個(gè)重要的因素就是心肌膠原纖維的喪失。而膠原的降解主要受鋅、鈣離子依賴的蛋白水解酶——MMPs的調(diào)控。

表2 各基因型高血壓患者左室肥厚情況Table 2.Left ventricular hypertrophy in hypertensive patients with different genotypes and alleles

MMPs是一組能特異降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的Zn2+依賴的酶，在組織重構(gòu)中起重要作用。至今發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)有5大類(lèi)24種MMPs。MMPs主要分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素及膜型 MMPs(MTMMPs)。各種MMPs以酶原的形式分泌到細(xì)胞外后，在其它酶的作用下前肽裂解而激活［4］，已經(jīng)證明MMPs活性在基因轉(zhuǎn)錄、酶原合成、酶活化水平上受多種因素調(diào)節(jié)。在心血管系統(tǒng)的重構(gòu)過(guò)程中MMPs通過(guò)影響ECM的降解在高血壓病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。MMP-3又稱(chēng)為基質(zhì)溶解素1(stromelysin 1)，分子量為57 kD，在 MMPs家族中具有獨(dú)特的功能，它不僅可以降解纖維連接蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型膠原等多種底物，還有激活其它種類(lèi)MMPs的作用，它是MMPs家族激活的共同途徑，MMP-3通過(guò)膠原降解及激活其它MMPs直接參與了心肌的重構(gòu)。Saglam等［5］研究發(fā)現(xiàn)血漿MMP-3和MMP-9在高血壓左室肥厚的患者明顯升高，并與左室后壁厚度呈正比，因此提出在降低血壓的同時(shí)降低MMPs濃度對(duì)于左室舒張功能有改善作用。在綿羊左室肥厚模型中觀察到代償性左室肥厚伴隨包括MMP-3在內(nèi)的多種MMPs升高［6］。對(duì)擴(kuò)張性心肌病的研究發(fā)現(xiàn)，左心室心肌細(xì)胞MMP-3活性比正常對(duì)照高4倍。MMPs表達(dá)和活性升高，參與了早期左室心肌的重構(gòu)，應(yīng)用MMPs抑制劑，可減少左室擴(kuò)張程度并改善泵功能，因此作者提出調(diào)整心肌MMPs的表達(dá)和活性，可作為控制心肌基質(zhì)重構(gòu)的重要治療目標(biāo)［7］。Hayashidani等［8］研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠心室肌中MMPs活性增高，TIMPs-3的含量減少，同時(shí)心室肌膠原纖維束變細(xì)、斷裂，膠原含量減少，表明MMPs活性增高，TIMPs-3的減少增加了基質(zhì)的重構(gòu)，使心功能從代償期轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥斊凇Ｐ墓δ茉讲?，MMP-3在心肌組織的表達(dá)越高，其與左室射血分?jǐn)?shù)、心指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。單純的II型糖尿病人血漿MMP-3水平與正常人沒(méi)有差別，而當(dāng)糖尿病合并有大血管病變時(shí)，其MMP-3水平顯著升高，說(shuō)明MMP-3參與了糖尿病大血管病變的發(fā)生［9］。我們的研究觀察到MMP-3血清水平與左室肥厚指標(biāo)正相關(guān)，可能是MMP-3過(guò)度表達(dá)引起ECM降解增加，膠原網(wǎng)結(jié)構(gòu)的破壞，使心肌細(xì)胞之間的連接趨于松散，心肌細(xì)胞排列紊亂，室壁厚度增加。體外細(xì)胞培養(yǎng)顯示，正常情況下，α-I型、α-II型膠原纖維表達(dá)與MMP-3的表達(dá)一致，當(dāng)α-I型、α-II型膠原纖維表達(dá)增加而MMP-3表達(dá)降低時(shí)，組織增厚，形成瘢痕組織［10］。

MMP-3的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平受到啟動(dòng)子基因調(diào)節(jié)，近年研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)MMP-3基因啟動(dòng)子區(qū)域1171位點(diǎn)存在5A和6A兩個(gè)等位基因，有研究證實(shí)5A/6A多態(tài)性造成MMP-3基因轉(zhuǎn)錄活性不同，5A純合子的蛋白表達(dá)是5A/6A雜合子的4倍，而6A純合子則比5A/6A雜合子低2倍［11］。不同基因型對(duì)心血管疾病的作用亦不同，我們的資料顯示5A基因型比6A基因型有較大的左室重量和左室重量指數(shù)，室間隔和左室后壁在5A基因型似乎比6A基因型更厚。攜帶5A基因型高血壓患者發(fā)生左室肥厚的可能性是攜帶6 A基因型高血壓患者的2倍。我們分析原因可能因?yàn)?A基因型MMP-3活性表達(dá)較高，引起基質(zhì)膠原成份降解，破壞正常的間質(zhì)支持結(jié)構(gòu)，破壞了心肌間質(zhì)纖維膠原合成和降解之間的動(dòng)態(tài)平衡，使心臟重量增加，心肌纖維化和肥大。但是不同人種、不同研究人群MMP-3基因多態(tài)性對(duì)心血管的影響不盡相同，一項(xiàng)Meta分析顯示歐洲人群攜帶5A等位基因者心血管病的危險(xiǎn)下降，而東亞人群正好相反，攜帶5A等位基因者心血管病的危險(xiǎn)性升高［12］。這可能與歐洲人群和亞洲人群5A/6A等位基因頻率相差較大有關(guān)，另一種可能是存在其它位點(diǎn)的基因和一些未知因素的交互作用，因此，對(duì)于MMP-3基因多態(tài)性與心血管病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，還需從不同角度進(jìn)行深入的研究。

［1］ Zile MR，Desantis SM，Baicu CF，et al.Plasma biomarkers that reflect determinants of matrix composition identify the presence of left ventricular hypertrophy and diastolic heart failure［J］.Circ Heart Fail，2011，4(3):246-256.

［2］ Ahmed SH，Clark LL，Pennington WR，et al.Matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of metalloproteinases:relationship between changes in proteolytic determinants of matrix composition and structural，functional，and clinical manifestations of hypertensive heart disease［J］.Circulation，2006，113(17):2089-2096.

［3］ Brionesa AM，Arribasb SM，Salaices M.Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2010，19(2):187-194.

［4］ Lemarie CA，Tharaux PL，Lehoux S.Extracellular matrix alterations in hypertensive vascular remodeling［J］.J Mol Cell Cardiol，2010，48(3):433-439.

［5］ Saglam M，Karakaya O，Esen AM，et al.Contribution of plasma matrix metalloproteinases to development of left ventricular hypertrophy and diastolic dysfunction in hypertensive subjects［J］.Tohoku J Exp Med，2006，208(2):117-122

［6］ Schubert A，Walther T，F(xiàn)alk V，et al.Extracellular matrix gene expression correlates to left ventricular mass index after surgical induction of left ventricular hypertrophy［J］.Basic Res Cardiol，2001，96(4):381-387.

［7］ Spinale FG，Coker ML，Bond BR，et al.Myocardial matrix degradation and metalloproteinase activation in the failing heart:a potential therapeutic target［J］.Cardiovasc Res，2000，46(2):225-238.

［8］ Hayashidani S，Tsutsui H，Ikeuchi M，et al.Targeted deletion of MMP-2 at tenuates early LV rupture and late remodeling after experimental myocardial infarction［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(3):H1229-H1235.

［9］ 徐 磊，盧興國(guó)，陳懷紅，等.基質(zhì)金屬蛋白酶3和尿激酶型纖溶酶原激活物受體在2型糖尿病大血管病變中的變化［J］.中國(guó)病理生理雜志，2007，23(5):897-899.

［10］ McFarland KL，Glaser K，Hahn JM，et al.Culture medium and cell density impact gene expression in normal skin and abnormal scar-derived fibroblasts［J］.J Burn Care Res，2011，32(4):498-508.

［11］ Medley TL，Kingwell BA，Gatzka CD，et al.Matrix metalloproteinase-3 genotype contributes to age-related aortic stiffening through modulation of gene and protein expression［J］.Circ Res，2003，92(11):1254-1261.

［12］ Koch W，de Waha A，Hoppmann P，et al.Haplotypes and 5A/6A polymorphism of the matrix metalloproteinase-3 gene in coronary disease:case-control study and a meta-analysis［J］.Atherosclerosis，2010，208(1):171-176.