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    皖南地區(qū)眼鏡蛇毒活性組分鎮(zhèn)痛效應(yīng)的初步研究*

    2013-11-07 06:02:46閔志雪包鵬舉王海華張根葆
    中國病理生理雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:扭體熱板眼鏡蛇

    閔志雪, 黃 璐, 孫 瑤, 包鵬舉,2, 王海華,2, 張根葆△

    疼痛是腦對(duì)急性或慢性組織損傷所引起的傷害性傳入進(jìn)行抽象和概括后所形成的不愉快感覺,常常伴有復(fù)雜的自主神經(jīng)活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)反射、心理和情緒反應(yīng)。藥物是疼痛治療最常用和最基本的方法。目前缺乏作用強(qiáng)、不成癮、可長期安全服用的鎮(zhèn)痛藥。因此鎮(zhèn)痛效果良好而不具成癮性的鎮(zhèn)痛藥的開發(fā)研究一直是疼痛控制的路徑之一。

    二十世紀(jì)初,人們就開始應(yīng)用蛇毒治療疼痛,與傳統(tǒng)藥物相比,蛇毒鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)痛時(shí)間長,無成癮性和耐藥性,用量少,對(duì)頑固性疼痛、神經(jīng)性疼痛和癌性疼痛都有效[1]。自發(fā)現(xiàn)粗毒具有鎮(zhèn)痛活性以來,國內(nèi)外分離純化發(fā)現(xiàn)約百余種鎮(zhèn)痛組分,從成分復(fù)雜的粗毒中分離純化尋找可靠的純度較高而效果良好的鎮(zhèn)痛組分,并對(duì)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)、作用機(jī)制進(jìn)行研究具有重要意義。皖南地區(qū)地處亞熱帶,氣候溫和,丘陵山地偏多,蛇的蘊(yùn)藏量相當(dāng)豐富。關(guān)于皖南地區(qū)眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛組分尚未見報(bào)道,因此對(duì)皖南地區(qū)眼鏡蛇毒中鎮(zhèn)痛成分進(jìn)行研究開發(fā)和應(yīng)用是一個(gè)很有價(jià)值的研究方向。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 主要儀器與試劑 AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(Pharmacia),pHs-3B型 pH計(jì)(上海雷磁儀器廠),RB智能熱板儀(四川成都儀器廠),眼鏡蛇毒由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供,P/ACE MDQ高效毛細(xì)管電泳液(貝克曼庫爾特公司),SP Sephadex C-50和Sephadex G-50為Pharmacia產(chǎn)品;透析袋,截留相對(duì)分子量3 500(Sigma),鹽酸嗎啡(morphine chloride)注射液(批號(hào)101006-1)購自沈陽第一制藥廠,低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自上海生工公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠244只,體重(20±2)g,由南京青龍山動(dòng)物繁殖場提供(批號(hào)為SCXK蘇2007-0001),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)定。

    2 方法

    2.1 眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛因子(cobra venom analgesic factor,CVAF)的分離純化和保存 純化方法參考童富淡等[2],對(duì)皖南地區(qū)眼鏡蛇粗毒使用陽離子交換色譜(cation-exchange chromatography,CEC)和分子排阻層析(size exclusion chromatography,SEC)進(jìn)行分離純化,取0.5 g眼鏡蛇毒凍干粉對(duì)眼鏡蛇粗毒進(jìn)行預(yù)處理后溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中,6 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清0.22 μm 濾膜過濾后備用。平衡后過SP Sephadex C-50陽離子交換色譜,柱規(guī)格為1.7 cm ×40.0 cm,洗脫液0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH=6,流速為1 mL/min,每管6 mL,分段梯度洗脫;測定A280,繪制洗脫曲線,收集各峰洗脫液。使用小鼠熱板法篩選鎮(zhèn)痛活性明顯的組分進(jìn)行Sephadex G-50純化,柱規(guī)格為1.6 cm×50.0 cm,洗脫液為生理鹽水,流速為 0.5 mL/min,直線洗脫。脫鹽、脫水后將洗脫液配成一定的濃度分裝于凍干管中(每管1 mL),4℃下放置30 min后,轉(zhuǎn)至-20℃下保存30 min,再置于-80℃中預(yù)凍3 h,最后經(jīng)冷凍干燥機(jī)真空凍干24 h。將制成的蛇毒凍干粉于-20℃中密封保存。

    2.2 CVAF的純度和相對(duì)分子量測定

    2.2.1 SDS-PAGE 采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進(jìn)行十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),分離膠(T=20%,pH 8.8)和濃縮膠(T=5%,pH 6.8),以Tris-HCl溶液為緩沖系統(tǒng),向加樣槽孔中加入20 μL制備好的樣品以及6 μL超低分子量蛋白質(zhì)marker;電泳裝置與電源相連,濃縮膠上所加電壓90 V,當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后,把電壓提至140 V,繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部,關(guān)閉電源;電泳完畢后,小心取出凝膠,置于染色液中染色過夜;染色完畢后,將凝膠置于脫色液中脫色,并輕輕晃動(dòng)至藍(lán)色背景消失為止。凝膠掃描,記錄條帶,計(jì)算Rf值,用分子量的對(duì)數(shù)作圖,以marker為對(duì)照,計(jì)算樣品分子量。

    2.2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(capillary zone electrophoresis,CZE) 電泳分離條件:0.05 mol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液,1 mL樣品(濃度為1 g/L)放入4℃樣品盒中,壓力(20 psi)進(jìn)樣5 s,毛細(xì)管長60.2 cm,有效內(nèi)徑50 cm×75 μm,檢測波長198 nm,運(yùn)行電壓25 kV,卡盒溫度25℃,運(yùn)行時(shí)間15 min。

    2.3 CVAF的鎮(zhèn)痛活性測定

    2.3.1 熱板法 選取18~22 g昆明種雌性小鼠50只,基礎(chǔ)痛閾大于5 s小于30 s,測量2次取平均痛閾作為基礎(chǔ)痛閾,按痛閾區(qū)組隨機(jī)化分成生理鹽水正常對(duì)照組、鹽酸嗎啡陽性對(duì)照組和CVAF實(shí)驗(yàn)組(高劑量組、中劑量組和低劑量組),每組10只。生理鹽水組腹腔注射0.2 mL生理鹽水;鹽酸嗎啡組腹腔注射0.2 mL鹽酸嗎啡(劑量5 mg/kg);CVAF組腹腔注射 0.2 mL CVAF,劑量分別為 0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg。以舔后足為痛反應(yīng)指標(biāo),以小鼠痛反應(yīng)時(shí)間為痛閾,觀察痛閾變化。痛閾提高率(%)=(給藥后痛閾-給藥前基礎(chǔ)痛閾)/生理鹽水組痛閾×100%。

    2.3.2 醋酸扭體法 選取18~22 g昆明種小鼠50只,隨機(jī)化分為生理鹽水正常對(duì)照組、鹽酸嗎啡陽性對(duì)照組和CVAF實(shí)驗(yàn)組(高劑量組、中劑量組和低劑量組),每組10只。室溫22~26℃。生理鹽水組腹腔注射0.2 mL生理鹽水;鹽酸嗎啡組腹腔注射0.2 mL鹽酸嗎啡(劑量5 mg/kg);CVAF組腹腔注射0.2 mL CVAF,劑量分別為0.03 mg/kg、0.1 mg/kg 和 0.3 mg/kg,1 h 后 ip 0.8%醋酸0.1 mL/10 g,以小鼠腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起、后肢伸長等行為反射稱為完整扭體反應(yīng)1次。觀察15 min以內(nèi)扭體次數(shù)。計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率。抑制率(%)=(空白組扭體數(shù) -給藥組扭體數(shù))/空白組扭體數(shù) ×100%。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示,多組均數(shù)比較用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較用SNK法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

    結(jié) 果

    1 CVAF的分離純化

    經(jīng)SP Sephadex C-50陽離子交換色譜后呈5個(gè)峰(圖1),小鼠熱板法預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第5峰鎮(zhèn)痛活性明顯,取第5峰經(jīng)Sephadex G-50進(jìn)一步純化,得到3個(gè)峰,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第2峰具有鎮(zhèn)痛活性,收集第2峰洗脫液,裝透析袋,脫鹽、脫水、凍干后呈粉末狀。

    Figure 1.Cation-exchange chromatography of crude snake venom on SP Sephadex C-50圖1 粗蛇毒的SP Sephadex C-50陽離子交換色譜圖

    2 SDS-PAGE凝膠垂直電泳

    結(jié)果顯示CVAF相對(duì)分子質(zhì)量為6 500 D,呈單一條帶,見圖2。

    Figure 2.SDS-PAGE analysis of CVAF.圖2CVAF的SDS-PAGE凝膠垂直電泳分析

    3 毛細(xì)管區(qū)帶電泳

    結(jié)果顯示CVAF樣品為單峰,與SDS-PAGE凝膠垂直電泳結(jié)果基本一致,見圖3。

    Figure 3.Capillary zone electrophoresis analysis of CVAF.圖3 CVAF的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析

    4 鎮(zhèn)痛活性測定

    4.1 熱板法 在小鼠熱板法實(shí)驗(yàn)中測定熱刺激反應(yīng)顯示嗎啡組在給藥0.5 h后達(dá)高峰,6 h鎮(zhèn)痛作用消失;0.5 h時(shí)0.3 mg/kg CVAF組小鼠痛閾與嗎啡組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF在給藥后痛閾提高百分率分別為9.31%、53.78%和79.23%;2 h時(shí)CVAF 0.3 mg/kg組小鼠痛閾與嗎啡組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05);0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF在給藥后痛閾提高百分率分別為11.23%、74.44%和117.44%,6 h時(shí)0.3 mg/kg的CVAF組小鼠痛閾與嗎啡組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和 0.3 mg/kg CVAF 在給藥后痛閾提高百分率分別為62.81%、95.58%和155.86%;0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和 0.3 mg/kg的CVAF在給藥后8 h小鼠痛閾提高百分率分別為42.08%、67.86%和136.17%。CVAF的鎮(zhèn)痛作用自0.5 h開始,且持續(xù)8 h仍存在。上述結(jié)果顯示CVAF能使小鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)時(shí)間延長,且具劑量相關(guān)性,見圖4。

    4.2 醋酸扭體法 在醋酸扭體實(shí)驗(yàn)中,腹腔注射0.03 mg/kg、0.1 mg/kg 和0.3 mg/kg CVAF 后,隨著劑量增加,0.1 mg/kg和0.3 mg/kg小鼠扭體次數(shù)與對(duì)照組相比,差異顯著(P<0.01);0.3 mg/kg小鼠扭體次數(shù)與嗎啡組相比無明顯差異(P>0.05)。小鼠扭體抑制率分別為27%、50%和70%,說明CVAF能降低小鼠對(duì)化學(xué)刺激引起的敏感性,見表1。

    討 論

    Figure 4.Analgesic effect of CVAF examined by hot-plate test.Mean ±SD.n=10.*P <0.05,**P <0.01 vs NS group;#P <0.05,##P <0.01 vs morphine group.圖4 熱板法測定CVAF對(duì)小鼠痛閾的影響

    表1 CVAF組分對(duì)小鼠醋酸扭體次數(shù)的影響Table 1.The effect of CVAF on mice in acetic acid writhing test(mean±SD.n=10)

    皖南地區(qū)蛇毒資源豐富,蛇毒中有效成分的開發(fā)和應(yīng)用具有廣闊的應(yīng)用前景。蛇毒是一種天然生物毒庫,具有抗凝[3]、鎮(zhèn)痛[4]、抗腫瘤等[5]廣泛的生物學(xué)及藥理學(xué)活性。疼痛是多種疾病引起的常見臨床癥狀,已成為繼呼吸、脈搏、體溫和血壓之后的“第五大生命指征”。臨床常用的鎮(zhèn)痛藥主要為非甾體類抗炎藥和阿片類強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥。前者以阿司匹林為代表,是弱鎮(zhèn)痛藥;后者以嗎啡為代表,是強(qiáng)鎮(zhèn)痛藥。非甾體類抗炎藥具有抗炎、退熱和鎮(zhèn)痛作用,臨床用途較廣,作為鎮(zhèn)痛藥主要用于慢性疼痛。其特點(diǎn)是鎮(zhèn)痛作用溫和,無成癮性。缺點(diǎn)是鎮(zhèn)痛強(qiáng)度不夠,消化道不良反應(yīng)較嚴(yán)重,個(gè)別藥物有心血管不良反應(yīng)、肝毒性或過敏反應(yīng)。阿片類鎮(zhèn)痛藥是麻醉性鎮(zhèn)痛藥,臨床限于急性銳痛的短期止痛,如外科手術(shù)和術(shù)后止痛、骨折及急性內(nèi)臟絞痛,也用于一些終末期患者無法治療的頑固性疼痛,如晚期癌癥的劇烈疼痛。其特點(diǎn)是起效快,鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)。缺點(diǎn)是具有成癮性,耐受性,引起呼吸抑制、內(nèi)分泌機(jī)能減退等嚴(yán)重不良反應(yīng)[6]。目前缺乏作用強(qiáng)但不成癮,可長期安全服用的鎮(zhèn)痛藥。1936年Macht等曾報(bào)道與強(qiáng)鎮(zhèn)痛類藥物如嗎啡相比,眼鏡蛇毒治療因癌組織壓迫神經(jīng)引起疼痛的晚期癌癥病人有顯著療效。與強(qiáng)鎮(zhèn)痛類藥物如嗎啡相比,眼鏡蛇毒制劑無麻醉作用,作用持久,連續(xù)應(yīng)用無耐受,不成癮;相反地在出現(xiàn)療效后用量可遞減。但是鎮(zhèn)痛作用起效較慢以及其它副作用限制其臨床的應(yīng)用。因此,成分復(fù)雜的粗毒中分離純化出純度較高而效果良好的鎮(zhèn)痛組分,并對(duì)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)、作用機(jī)制進(jìn)行研究具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用離子交換色譜和排阻層析結(jié)合的方法對(duì)皖南地區(qū)眼鏡蛇粗毒進(jìn)行分離純化篩選得到一種鎮(zhèn)痛因子CVAF,相對(duì)分子量為6.5 kD,從 SDS-PAGE電泳來看可呈單一主帶,可認(rèn)為達(dá)到電泳純。

    通過急性生理性疼痛模型小鼠熱板法及化學(xué)致痛模型醋酸扭體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物具有劑量依賴性的中樞和外周鎮(zhèn)痛作用,熱板法為熱刺激疼痛模型,舔足底動(dòng)作不僅是脊髓反應(yīng),而且與高級(jí)中樞有關(guān)。小鼠熱板法是通過足部溫度感受器感受熱刺激,信息經(jīng)軀體神經(jīng)的傳入,在有高位中樞參與下完成的軀體縮爪反應(yīng)。熱板法實(shí)驗(yàn)顯示CVAF的鎮(zhèn)痛作用自0.5 h開始,且持續(xù)8 h仍存在。扭體法中0.03 mg/kg、0.1 mg/kg和0.3 mg/kg CVAF 在給藥后小鼠扭體抑制率分別為27%、50%和70%。呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,高劑量組鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于嗎啡組。提示CVAF對(duì)化學(xué)物質(zhì)刺激致痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。熱板法和扭體法致痛的原因、性質(zhì)、傳導(dǎo)途徑、強(qiáng)度各有差別,提示CVAF的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制十分復(fù)雜,可能涉及多種通路。疼痛的產(chǎn)生及調(diào)控是涉及多部位多機(jī)制的復(fù)雜過程,目前研究發(fā)現(xiàn)蛇毒鎮(zhèn)痛可能與膽堿能系統(tǒng)[7-8]、NO/cGMP/PKG 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9-10]、巨噬細(xì)胞活性抑制[11]、內(nèi)源性阿片系統(tǒng)等[12]有關(guān),接下來我們將建立炎性痛和病理性神經(jīng)痛模型,測定行為學(xué)和血清學(xué)指標(biāo),從而對(duì)其確切的鎮(zhèn)痛機(jī)制做進(jìn)一步的探討,為臨床鎮(zhèn)痛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    此外在本研究中,為了排除蛇毒自身毒副作用對(duì)動(dòng)物的影響[13],我們使用功能觀測組合檢查方法觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的表現(xiàn),發(fā)現(xiàn)治療量的眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛因子對(duì)動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)、進(jìn)食無明顯影響,未發(fā)現(xiàn)異常的體位、活動(dòng)水平和步態(tài);未發(fā)現(xiàn)異常行為如強(qiáng)迫性噬咬、自殘、轉(zhuǎn)圈和后退等;未出現(xiàn)痙攣、震顫、流淚、紅色淚液、流延、腹瀉和嘶咬等表現(xiàn),說明CVAF的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能與其毒性無關(guān)。

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