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    PCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA在鑒別克羅恩病與腸結(jié)核中的價(jià)值*

    2013-11-07 06:02:50陳瑜君陳白莉徐萍萍曾志榮陳旻湖胡品津
    中國(guó)病理生理雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:腸結(jié)核克羅恩肉芽腫

    陳瑜君, 何 瑤, 陳白莉, 毛 仁, 晁 康, 徐萍萍, 曾志榮, 陳旻湖, 胡品津

    腸結(jié)核(intestinal tuberculosis,ITB)和克羅恩病 (Crohn disease,CD)臨床表現(xiàn)有很多相似之處,且病理特征上都具有肉芽腫形成的特點(diǎn),較難區(qū)別2種疾病。克羅恩病是一組發(fā)病機(jī)制不明的腸道炎癥性疾病,其發(fā)病機(jī)制認(rèn)為與腸道細(xì)菌和環(huán)境因素作用于遺傳易感的人群,引起異常免疫反應(yīng)有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌感染作為ITB的病因已明確,因此從病原學(xué)檢測(cè)的角度出發(fā),探索在腸結(jié)核患者中直接檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌 DNA(Mycobacterium tuberculosis,MTB)快捷有效的方法對(duì)鑒別兩病重要意義。

    ITB是由人型MTB感染所致的特異性腸道炎癥。結(jié)核菌在感染人體后,多處于潛伏狀態(tài),它能在宿主細(xì)胞內(nèi)逃逸宿主的防御作用而大量繁殖,一般情況下,約10%的感染者可發(fā)展為致病性結(jié)核,在病灶檢測(cè)到結(jié)核桿菌可診斷結(jié)核。IS6110[1-2]是 MTB基因組中一個(gè)多拷貝的保守片段,有1 361 bp的核苷酸和28 bp的反向末端重復(fù)序列,MTB中含有該序列10~20拷貝,具有較高的敏感性。該序列僅存在于人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌(包括BCG)和非洲結(jié)核分枝桿菌中,亦具有較高的特異性。根據(jù)IS6110設(shè)計(jì)引物的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)具有高敏感性和高特異性的優(yōu)點(diǎn),特別是菌量少時(shí)更能顯示出該技術(shù)的優(yōu)越性。本研究旨在通過PCR技術(shù)檢測(cè)ITB與CD患者腸道組織的MTB,探索進(jìn)行快速M(fèi)TB病原學(xué)診斷試驗(yàn)方法在確診ITB中的可行性及價(jià)值,同時(shí)為ITB和CD鑒別診斷提供方便快捷的方法。

    材料和方法

    1 組織標(biāo)本

    石蠟標(biāo)本來自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2002年~2011年檔案保存病例,其中ITB 25例,CD 25例。所有標(biāo)本通過HE染色切片,由病理學(xué)家重新讀片確定病理診斷。病人有完整臨床病理資料及內(nèi)鏡資料,由消化內(nèi)科專家重新分析臨床資料,確定臨床診斷。所有患者取材前未接受抗結(jié)核治療。

    2 陽(yáng)性對(duì)照菌株

    陽(yáng)性對(duì)照菌株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA由廣州市胸科醫(yī)院研究所惠贈(zèng)。

    3 主要儀器

    ABI 9700 PCR儀。

    4 石蠟組織DNA的提取

    腸結(jié)核和克羅恩病患者腸道組織DNA提取自石蠟包埋組織,采用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)試劑盒提取。具體操作如下:(1)從腸結(jié)核患者和克羅恩病患者石蠟組織標(biāo)本中切取8 μm×8張的切片;(2)分次加入適量二甲苯、無水乙醇溶解蠟塊,并加入50 μL溶菌酶;(3)加入180 μL的ATL緩沖液;(4)加入20 μL蛋白酶K(protease K),將離心管放入56℃水浴箱直至組織完全溶解,加長(zhǎng)溶解時(shí)間,可過夜,此過程需不時(shí)振蕩離心管以分散組織;(5)依據(jù)說明書分次加入Buffer AL、無水乙醇溶解;(6)取上述混合液入QIAamp柱中,據(jù)說明書分次加入Buffer AW1、Buffer AW2和Buffer AE提取DNA。

    5 DNA完整性的判斷

    1.5 %瓊脂糖,電壓100 V,20 ~30 min。

    6 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

    引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì),均由廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司合成。具體序列及片段長(zhǎng)度:目的基因IS6110引物正義鏈5'-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3',反義鏈 5'-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3',目的產(chǎn)物長(zhǎng)度123 bp。內(nèi)參照β-actin引物正義鏈5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3',反義鏈5'-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度 106 bp。

    7 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

    50 μL 反應(yīng)體系:PCR Mix 20 μL,ddH2O 6 μL,Primer F 2 μL,Primer R 2 μL,DNA 20 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃ 5 min,93℃ 30 s,60℃ 45 s,72℃35 s,35 個(gè)循環(huán)。

    8 電泳

    于含有溴化乙啶染色的2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外線下觀察結(jié)果。

    9 測(cè)序

    抽樣測(cè)序擴(kuò)增出目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,由華大基因測(cè)序,采用雙向測(cè)序。PCR產(chǎn)物測(cè)序所得基因序列在 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)。

    10 質(zhì)量控制

    本實(shí)驗(yàn)采用多項(xiàng)措施控制質(zhì)量,避免污染及減少假陰性:(1)操作過程Eppendorf管開蓋操作均在生物安全柜中進(jìn)行;(2)每輪反應(yīng)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照;(3)擴(kuò)增陰性者均重復(fù)2次,3次擴(kuò)增均陰性者方可判斷為陰性。

    11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    選用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,兩組陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 MTB DNA PCR有助于確診ITB

    如表1中所示,ITB標(biāo)本中MTB PCR陽(yáng)性率為32%(8/25),CD標(biāo)本中 MTB PCR陽(yáng)性率為0%(0/25)。MTB DNA PCR法在ITB和CD鑒別診斷中的靈敏度為32%,特異度為100%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%,陰性預(yù)測(cè)值59.5%。而在本組病例中抗酸染色法和病理確診(干酪樣壞死)靈敏度僅分別為8%和12%,PCR敏感性明顯高于抗酸染色(P<0.05)和干酪樣壞死(P<0.05)。

    表1 腸結(jié)核組與克羅恩病組MTB PCR檢測(cè)結(jié)果Table 1.Positive results of MTB DNA PCR in ITB and CD groups

    圖1所示為MTB PCR結(jié)果,目的電泳條帶長(zhǎng)度為123 bp。所有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均出現(xiàn)預(yù)期相應(yīng)的陽(yáng)性及陰性結(jié)果。PCR測(cè)序由華大基因完成,采用雙向測(cè)序,PCR產(chǎn)物測(cè)序所得基因序列在Gen-Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),結(jié)果顯示與電泳結(jié)果相符,圖2示部分測(cè)序結(jié)果。

    Figure 1.PCR results for MTB DNA detection.1:negative control;2:intestinal tuberculosis sample;3:Crohn disease sample;4:positive control;5:DNA marker.圖1 IS6110 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    Figure 2.Target DNA PCR product sequencing figure(part).圖2 PCR擴(kuò)增出目的條帶標(biāo)本的PCR產(chǎn)物測(cè)序圖(部分)

    2 PCR法陽(yáng)性率與病理特征的關(guān)系

    如圖3所示,25例ITB患者石蠟切片標(biāo)本發(fā)現(xiàn)肉芽腫的共12例,有肉芽腫標(biāo)本PCR陽(yáng)性率為41.7%,無肉芽腫組陽(yáng)性率為23.1%,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步分析肉芽腫數(shù)目與PCR陽(yáng)性率間的關(guān)系,肉芽腫數(shù)目≥2個(gè)/切片的標(biāo)本7例,PCR的陽(yáng)性率為42.9%,肉芽腫數(shù)目=1個(gè)/切片的標(biāo)本5例,2例PCR陽(yáng)性,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。9例標(biāo)本可見多核巨細(xì)胞,PCR陽(yáng)性率為44.4%,不含巨核細(xì)胞標(biāo)本的陽(yáng)性率為25.0%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中1例為僅含離散的多核巨細(xì)胞,PCR結(jié)果陰性。2例同時(shí)含離散多核巨細(xì)胞和肉芽腫內(nèi)多核巨細(xì)胞,1例PCR結(jié)果陽(yáng)性。6例多核巨細(xì)胞僅位于肉芽腫內(nèi),有3例PCR結(jié)果陽(yáng)性。圖4示部分典型病理表現(xiàn)。

    Figure 3.The relationship between MTB DNA positive rate and pathological features.Big granulomas:diameter ≥200 μm;small granulomas:diameter < 200 μm;multiple granulomas:granuloma number≥2 each specimen.圖3 PCR法檢測(cè)MTB DNA陽(yáng)性率與病理特征的關(guān)系

    Figure 4.Typical pathological manifestations of ITB and CD.A(×100),B(×200)and C(×100)showed caseation necrosis,horseshoe-shaped or wreath-like multinucleated giant cells and dense fused granulomas,respectively,supporting ITB;D(×400),E(×100)and F(×200)revealed ganglion cells,fissure-like ulcer and loose small granulomas,respectively,supporting CD.圖4 腸結(jié)核和克羅恩病的部分典型病理表現(xiàn)

    討 論

    ITB和CD的鑒別診斷一直是臨床難題。如果將CD誤診為ITB,將導(dǎo)致不必要的抗結(jié)核治療和藥物毒性,及導(dǎo)致CD的治療延遲。反之,如果將ITB誤診為CD,采用激素、免疫抑制劑甚至生物制劑治療可使病情惡化甚至死亡。目前對(duì)2種疾病的鑒別診斷主要依據(jù)內(nèi)鏡檢查和手術(shù)標(biāo)本組織病理,以及診斷性抗結(jié)核治療[3]。而典型臨床特征、結(jié)核桿菌抗酸染色、結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性等僅見于極少數(shù)患者,因此作為鑒別診斷依據(jù)的價(jià)值有限。結(jié)核桿菌PCR、小腸CT成像(CTE)和結(jié)核感染酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(T.SPOT.TB)成為目前較新的研究熱點(diǎn)[4]。

    MTB DNA PCR技術(shù)在PCR技術(shù)將病原體的檢測(cè)帶入了分子生物學(xué)時(shí)代時(shí)已嘗試應(yīng)用于此領(lǐng)域。其優(yōu)越性體現(xiàn)在:(1)敏感性高,尤其適用于ITB抗酸染色陰性或未見干酪樣壞死典型病例表現(xiàn)的標(biāo)本;(2)特異性高;(3)快速。1989年法國(guó)學(xué)者Brisson-Noёl等[5]首先報(bào)道將 PCR 技術(shù)用于診斷結(jié)核病。近年國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)對(duì)PCR技術(shù)應(yīng)用于ITB的診斷做了一些初步的探討。PCR在ITB的診斷中敏感性一般,但特異性很高。國(guó)內(nèi)以華西為代表的研究機(jī)構(gòu)做出的結(jié)果其敏感性可達(dá)60%以上[6-9],國(guó)外主要是印度和韓國(guó)結(jié)核較高發(fā)的國(guó)家在研究,其做出的敏感性在21.6% ~45.0%。而特異性都高達(dá)80%以上[10-12]。我們的研究MTB DNA檢查的陽(yáng)性率為32%,與報(bào)道相符。

    MTB DNA PCR假陰性的原因主要有:(1)活組織標(biāo)本:組織中結(jié)核分枝桿菌DNA的提取量小于PCR法檢出下限。MTB DNA在ITB病人的組織中濃度很低,分布不均勻,且內(nèi)鏡活檢組織,鉗取組織量少且淺。這些特征導(dǎo)致提取的DNA主要是組織DNA,不能有效地從分枝桿菌中提取結(jié)核DNA。(2)石蠟標(biāo)本:某些石蠟包埋組織陳舊,DNA已降解或破壞;組織的反復(fù)凍融也有可能破壞DNA。(3)實(shí)驗(yàn)技術(shù):DNA提取時(shí)結(jié)核分枝桿菌未破解成功,結(jié)核分枝桿菌包壁堅(jiān)韌,裂解困難,不除外提取的主要是組織DNA,部分分枝桿菌未充分裂解釋放出DNA。此外不排除商品化的DNA分離試劑則可能移除我們所要檢測(cè)的部分結(jié)核桿菌DNA,這將導(dǎo)致錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。

    針對(duì)上述可能出現(xiàn)的問題,我們的研究圍繞著DNA提取和PCR擴(kuò)增,建立穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)學(xué)方法提高實(shí)驗(yàn)可靠性和檢出率。(1)DNA提取是結(jié)核DNA PCR的關(guān)鍵,增加活檢數(shù)量和部位[13],在DNA提取前加入溶解酶,加大蛋白酶K的量、加長(zhǎng)溶解時(shí)間,盡量增強(qiáng)溶解效果。選用可達(dá)到較高濃度和純度產(chǎn)物的試劑盒。(2)PCR擴(kuò)增選擇MTB基因組中一個(gè)多拷貝的保守片段 IS6110 設(shè)計(jì)引物[1,14],具有較高的敏感性及高度特異性。(3)其次擴(kuò)增123 bp片段,避免了大片段因石蠟包埋處理過程的DNA降解、斷裂而導(dǎo)致的假陰性。(4)進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,并對(duì)結(jié)果陰性的標(biāo)本重復(fù)2次PCR擴(kuò)增。

    許多研究探討分枝桿菌PCR陽(yáng)性率與病理特征的關(guān)系,ITB特異性指標(biāo)干酪樣壞死和抗酸染色陽(yáng)性率低。大(直徑>200 μm)、致密、融合、邊界清的黏膜下肉芽腫傾向ITB。直徑小(<200 μm)、非融合、邊界不清、結(jié)構(gòu)排列疏松肉芽腫傾向于CD。多核巨細(xì)胞在腸結(jié)核和克羅恩病患者均可見。報(bào)道提示,PCR的陽(yáng)性率同病理特征有關(guān)[12],有特征性病理表現(xiàn)的組織PCR陽(yáng)性率更高。可能與結(jié)核分枝桿菌多存在于上皮樣肉芽腫形成部位有關(guān)。在我們的研究中,PCR的陽(yáng)性率在有肉芽腫、巨核細(xì)胞的標(biāo)本中較高,但未達(dá)顯著差異,考慮與樣本量小有關(guān)。大樣本研究、定量PCR和血清學(xué)檢測(cè)[15]等更敏感的方法是今后研究的方向。

    PCR法可用于結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè),隨著分子技術(shù)的不斷進(jìn)步,大大縮短了診斷所需時(shí)間,敏感性和特異性也不斷提高,是確診ITB以及研究ITB和CD鑒別診斷的一種方便快捷的輔助診斷方法。

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