• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    microRNA-21轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞移植對低溫條件下心力衰竭大鼠的影響*

    2013-10-25 00:47:33王夢洪
    中國病理生理雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:常溫心肌細(xì)胞心衰

    唐 艷, 王夢洪

    (1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,江西 南昌330006; 2南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,湖南 衡陽 421001)

    ·論著·

    microRNA-21轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞移植對低溫條件下心力衰竭大鼠的影響*

    唐 艷1,2, 王夢洪1△

    (1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,江西 南昌330006;2南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,湖南 衡陽 421001)

    目的探討microRNA-21對低溫條件下心力衰竭大鼠的影響。方法利用阿霉素及氣候箱建立常/低溫條件下心力衰竭大鼠模型,以心功能、心肌組織凋亡率及病理改變作為建模成功的觀察指標(biāo)。采用定量熒光PCR(qRT-PCR)檢測各組心肌組織microRNA-21的表達(dá)。體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞,標(biāo)記BrdU,構(gòu)建過表達(dá)microRNA-21的重組慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞。建模成功后將低溫條件下心力衰竭的大鼠隨機(jī)分為3組,分別注射轉(zhuǎn)染了過表達(dá)microRNA-21的重組慢病毒表達(dá)載體的心肌細(xì)胞 (I組)、單純心肌細(xì)胞 (II組)和DMEM培養(yǎng)基 (III組)。超聲心動圖檢測各組心功能。處死大鼠,留取心臟標(biāo)本進(jìn)行HE病理染色及免疫組化檢測。結(jié)果低溫條件下心力衰竭大鼠(d組)的心功能低于常溫條件下心力衰竭大鼠(c組);c組明顯低于常溫條件下正常大鼠(a組)。a組的心功能與低溫條件下正常大鼠(b組)無明顯差異。d組的心肌組織凋亡率高于c組;c組明顯高于a組。a組的心肌組織凋亡率與b組無明顯差異。microRNA-21在c組心肌組織中的表達(dá)低于a組;microRNA-21在d組心肌組織中的表達(dá)低于c組; microRNA-21在b組心肌組織中的表達(dá)低于a組;Ⅰ組microRNA-21的表達(dá)高于Ⅱ組(P<0.05);超聲檢測心功能提示I組和II組的心功能障礙輕于III組(P<0.05),尤以I組更顯著(P<0.05);免疫組化檢測顯示,移植的心肌細(xì)胞在移植區(qū)存活;HE染色顯示I組和II組的心力衰竭病理變化比Ⅲ組明顯減輕(P<0.05),尤以I組更顯著(P<0.05)。結(jié)論心肌細(xì)胞移植于低溫條件下心力衰竭大鼠能改善心功能,減輕心肌組織的心衰病理變化,其中microRNA-21轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞后移植效果更顯著,為microRNA-21未來診斷及治療低溫條件下心力衰竭提供了新思路。

    心力衰竭; 心肌細(xì)胞; MicroRNA-21; 移植

    隨著環(huán)境的變化,惡劣氣候等自然災(zāi)害已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康重要因素,對于已有基礎(chǔ)心臟疾病的患者,惡劣環(huán)境是導(dǎo)致患者死亡的主要因素之一。Feldman等[1]在1990~1998年期間對加拿大魁北克和法國充血性心衰患者的季節(jié)性病死率和住院率進(jìn)行了隊(duì)列分析,發(fā)現(xiàn)每年1月的病死率和住院率最高,9月最低,呈現(xiàn)明顯季節(jié)性變化趨勢。Sun等[2]發(fā)現(xiàn)低溫能通過增強(qiáng)交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性從而觸發(fā)多種心血管并發(fā)癥如中風(fēng)、心肌梗死、心衰等的發(fā)生。然而,目前對低溫條件下心力衰竭的概念一直不是很清晰,關(guān)于其病理生理分子機(jī)制和診治的研究迄今為止在國內(nèi)外仍未正式開展。

    MicroRNA是真核生物中一種長度約為22個(gè)核苷酸大小、參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA,可特異性識別靶mRNA的3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)并與之結(jié)合,從而降解靶mRNA,抑制翻譯,發(fā)揮其對基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控,調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞活動,參與眾多心血管疾病的病理生理過程[3-4]。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上千余種microRNA,其中microRNA-21在許多心血管疾病如心肌梗死[5]、心力衰竭[6]、心臟肥大中呈差異性表達(dá),參與多種心血管疾病的病理生理分子機(jī)制。近年來研究發(fā)現(xiàn)外界溫度的變化可能影響microRNA-21的表達(dá)。Biggar等[7]發(fā)現(xiàn)冰凍(-3 ℃,24 h)條件下青蛙肝臟和骨骼肌上microRNA-21的表達(dá)分別是非冰凍(5 ℃,24 h)條件下的1.5倍和1.3倍。Yin等[8]發(fā)現(xiàn)暴露于熱休克狀態(tài)下的小鼠心臟中microRNA-21的表達(dá)明顯上調(diào)。Gammell等[9]通過用生物測序和RT-PCR檢測人類、大鼠和小鼠microRNA的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中有26種microRNA在37 ℃和在31 ℃條件下呈差異性表達(dá),其中microRNA-21在31 ℃明顯上調(diào)。但是microRNA-21是否在低溫條件下的心力衰竭中發(fā)揮重要的作用,目前尚不清楚。

    心肌細(xì)胞移植是目前治療心力衰竭的一個(gè)熱門領(lǐng)域,它又稱細(xì)胞心肌成形術(shù)。近年來部分動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)心肌細(xì)胞移植可以部分地替代凋亡壞死的心肌細(xì)胞而有效改善心功能。然而單純的心肌細(xì)胞移植卻因?yàn)樗拗鞯蛲鍪軗p的心肌組織限制了移植的心肌細(xì)胞的存活與分化,大大降低了移植效率。如果能在心肌細(xì)胞移植的同時(shí),通過某種措施增加某種抗心肌細(xì)胞凋亡因子,勢必能同時(shí)抗宿主心肌細(xì)胞凋亡,提高移植功效,最終恢復(fù)宿主心功能[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn),microRNA-21是許多心血管疾病中的一個(gè)抗凋亡因子[11]。如果將能夠過表達(dá)microRNA-21的心肌細(xì)胞移植于受損的心肌組織,理論上一方面能改善宿主心功能,另一方面還有利于移植心肌細(xì)胞的存活和生長分化,防止心室重構(gòu)。本研究基于以上設(shè)想,將慢病毒介導(dǎo)的、過表達(dá)microRNA-21的乳鼠心肌細(xì)胞移植于低溫條件下心力衰竭大鼠的心肌組織中,觀察移植心肌細(xì)胞在宿主心肌組織的存活及對宿主心功能的影響。

    材 料 和 方 法

    1材料

    1.1動物 Sprague-Dawley乳鼠數(shù)百只(出生1~3 d), 成年雄性SD大鼠91只, 體重250~270 g, 由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

    1.2主要試劑及儀器 阿霉素(Sigma), TUNEL試劑盒(Promega),氣候箱(青島海爾集團(tuán)公司) , 超聲心動儀(GE), DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、胰蛋白酶及膠原酶II(Gibco), BrdU及BrdU抗體(Sigma), 過表達(dá)microRNA-21重組慢病毒表達(dá)載體(上海吉?jiǎng)P基因公司), 總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen), qRT-PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司), 臺式低溫高速離心機(jī)(Sigma), 定量熒光PCR儀(ABI PRISM 7500), 倒置顯微鏡(Olympus), β-actin鼠抗多克隆抗體(Santa Cruz)。

    2方法

    2.1心力衰竭動物模型制備及分組 雄性SD大鼠52只, 喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為常溫正常組(a組)、低溫正常組(b組)、常溫心衰組(c組)和低溫心衰組(d組), 每組13只,心衰組采用腹腔注射阿霉素造模, 阿霉素用量為每次2.5 mg/kg,每周星期一和星期四各注射1次,共5周, 常溫正常組和低溫正常組同時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水。所有組放在常溫條件下(25~28 ℃)5周, 5周后低溫正常組和低溫心衰組放置于氣候箱中(4 ℃, 3 h; 重復(fù)4 d), 常溫正常組和常溫心衰組仍放置于常溫條件下(25~28 ℃)。最后1 d行心臟彩超檢查及HE組織病理檢測, TUNEL法測心肌凋亡, 熒光定量PCR測心肌組織中microRNA-21的表達(dá)。

    2.2超聲心動圖檢查 選用GE vivid7彩色多譜勒超聲診斷儀,高頻探頭(12 MHz),Gain 50 dB,深度2.5 cm。(1) 心力衰竭動物模型:于心力衰竭動物模型造模最后1 d,腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,仰臥固定于木板上,胸部脫毛,接心電圖,取大鼠胸骨旁左室長軸切面測量左室舒張末徑(left ventricular internal dimension at end-diastole, LVIDd)、左室收縮末徑(left ventricular internal dimension at end-systole,LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)和縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening, FS)。(2) 用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型:移植前和移植2周后,用同法檢測各組心功能指標(biāo)。

    2.3組織學(xué)檢查 (1) 心力衰竭動物模型: 于心力衰竭動物模型造模最后1 d,超聲檢查完畢后, 戊巴比妥鈉過量麻醉處死大鼠, 取出左室心肌部分, 以10%甲醛固定, 常規(guī)石蠟包埋, 病理切片,將切片用二甲苯脫蠟,乙醇梯度脫水, HE染色, 光鏡下觀察。(2) 用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型:于移植2周后,用HE染色檢測各組心肌組織的病理變化。

    2.4TUNEL法檢測心肌組織凋亡率 實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照TUNEL檢測試劑盒說明書進(jìn)行。取出左室心肌部分、依次按照固定、包埋、切片、脫蠟、封閉、加TUNEL反應(yīng)液孵育、加抗熒光素抗體、DAB顯色、復(fù)染、脫水、封片等步驟進(jìn)行。以不加TdT酶者為陰性對照, 分別以用DNase I(10 mg/L)消化的左心室心肌切片為陽性對照。正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色, 凋亡心肌細(xì)胞核呈棕黃色。每只大鼠(光鏡下)觀察4張切片,每張切片在40倍視野下, 隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野的凋亡細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù), 計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的百分率, 取其平均值為凋亡指數(shù)(AI)。

    2.5組織及細(xì)胞總RNA提取和qRT-PCR檢測 取一定量的組織及細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后,依據(jù)產(chǎn)品說明書用Trizol裂解, 氯仿抽提總RNA。MicroRNA及內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成模板cDNA, 條件為37 ℃ 60 min,37 ℃ 60 min,-20 ℃保存。MicroRNA-21引物序列: 上游5’ -CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3’,下游5’ -GACTGTGACGACTACCCCAA-3’。產(chǎn)物片段長度為75 bp, 退火溫度為60 ℃,PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為40次。以U6為內(nèi)參照,其引物序列:上游5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’, 下游5’ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。產(chǎn)物片段長度為109 bp, 退火溫度為60 ℃, PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為40次。以上引物均由上海捷瑞生物有限公司合成提供的。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法分析。以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR, 取2 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物分別與microRNA-21引物和內(nèi)參照U6引物進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性2 min, 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。重復(fù)40次循環(huán)。在ABI PRISM 7500 REAL TIME PCR System上操作反應(yīng), 檢測microRNA-21的相對表達(dá)量。

    2.6用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型制備及分組 雄性SD大鼠39只, 喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為移植轉(zhuǎn)染了lenti-microRNA-21的心肌細(xì)胞組(I組)、移植單純心肌細(xì)胞組(II組)和移植DMEM培養(yǎng)基組(III組), 每組13只, 各組采用腹腔注射阿霉素造模, 阿霉素的量每次2.5 mg/kg, 每周注射2次, 共5周, 各組均放在常溫條件下(25~28 ℃)5周,5周后各組放置于氣候箱中(4 ℃, 3 h; 重復(fù)4 d), 最后1 d行心臟彩超檢查并進(jìn)行細(xì)胞移植。

    2.7Lenti-microRNA-21轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞及microRNA-21檢測 原代培養(yǎng)48 h后, 選生長良好的心肌細(xì)胞(貼壁伸展良好、細(xì)胞搏動佳),轉(zhuǎn)染lenti-microRNA-21 (MOI=10,n=3),設(shè)置單純心肌細(xì)胞組(只加培養(yǎng)基,n=3)。2組終末體積用含10%新生牛血清DMEM調(diào)至5 mL,24 h后換液加入含10%新生牛血清DMEM 10 mL, 37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),隔天換液。于第5 d(此時(shí)達(dá)到轉(zhuǎn)染高峰)收集心肌細(xì)胞,利用qRT-PCR檢測心肌細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá),并進(jìn)行心肌細(xì)胞移植。

    2.8移植細(xì)胞的準(zhǔn)備及移植 選生長良好的已轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染lenti-microRNA-21的乳鼠心肌細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,離心后,用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配成2×1010/L的細(xì)胞懸液。移植方法:20%烏拉坦(300 mg/kg,ip)聯(lián)合1.5%戊巴比妥(20 mg/kg,ip)復(fù)合麻醉及呼吸機(jī)支持下,經(jīng)左胸4或5肋間開胸,將100 μL細(xì)胞懸液或DMEM培養(yǎng)基多點(diǎn)斜行注射到大鼠心肌組織中,注射深度約0.5~0.8 mm。關(guān)胸并繼續(xù)飼養(yǎng)2周。術(shù)前24 h及術(shù)后每天予以環(huán)孢菌素A(諾華制藥)5 mg/kg皮下注射抑制免疫排斥反應(yīng),注射3 d左右,青霉素105U/kg皮下注射抗感染,注射3 d。

    2.9抗BrdU免疫組化檢查 實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照抗BrdU免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行,簡述如下:脫蠟、洗滌,0.5% H2O2室溫孵育封閉,正常馬血清室溫孵育,Ⅰ抗4 ℃孵育過夜,Ⅱ抗孵育45 min,親合素-生物素復(fù)合物(avidin-biotin complex,ABC)室溫孵育60 min,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)和H2O2孵育2~10 min,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡下觀察。

    3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析或t檢驗(yàn)比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1實(shí)驗(yàn)動物存活評價(jià)

    1.1心力衰竭動物模型 52只大鼠用于制作心力衰竭模型,建模過程中共計(jì)5只死亡,總死亡率9.6%,其中常溫正常組和低溫正常組無一死亡,常溫心衰組死亡2只,死亡率為15.4%,低溫心衰組死亡3只,死亡率為23.1%。

    1.2用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型 39只大鼠用于制作低溫條件下心力衰竭模型,在建立模型過程中共計(jì)9只死亡,總死亡率23%,其中每組的死亡數(shù)目均為3只。存活的30只大鼠入選移植實(shí)驗(yàn)。移植術(shù)后共有6只大鼠死亡,總死亡率20%,其中DMEM培養(yǎng)基移植組死亡3只,死亡率為30%,單純心肌細(xì)胞移植組死亡2只,死亡率為20%,轉(zhuǎn)染了lenti-microRNA-21的心肌細(xì)胞移植組死亡1只,死亡率為10%。

    2各組心臟功能的變化

    2.1心力衰竭動物模型 與常溫正常組相比,常溫心衰組LVIDd和LVIDs明顯增加(P<0.05), FS明顯降低(P<0.05)。而低溫心衰組相比常溫心衰組LVIDd和LVIDs進(jìn)一步增加(P<0.05), FS和EF進(jìn)一步降低(P<0.05), 提示低溫能惡化心力衰竭的進(jìn)展, 心功能進(jìn)一步降低。低溫正常組的LVIDd、LVIDs、FS和EF與常溫正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1。

    Figure 1. Cardiac functions of heart failure rats in the normal or cold environment detected by echocardiogram. LVIDd: left ventricular internal dimension at end-diastole; LVIDs: left ventricular internal dimension at end-systole; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening. Group a: normal rats in the normal environment (n=13); group b: normal rats in the cold environment (n=13); group c: heart failure rats in the normal environment (n=11); group d: heart failure rats in the cold environment (n=10). Mean±SD.#P<0.05vsgroup a;△P<0.05vsgroup c.

    圖1心臟彩超檢測正?;虻蜏貤l件下心衰大鼠的心功能

    2.2用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型 細(xì)胞移植后2周, 檢查顯示: I組和Ⅱ組中EF與移植前相比有明顯差別。與III組相比, I組和II組的LVIDd和LVIDs減小(P<0.05), EF和FS增加(P<0.05)。與II組相比, I組EF和FS增加(P<0.05),LVIDd和LVIDs減小(P<0.05)。I組及Ⅱ組移植后較移植前心臟射血功能增加,室壁變厚,心腔變小; III組移植后較移植前室壁運(yùn)動、室壁厚度和心腔大小無差別。上述結(jié)果提示移植單純心肌細(xì)胞組和移植轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞組較移植單純DMEM培養(yǎng)基組心功能明顯改善,尤以移植轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞組更明顯,見圖2和表1。

    Figure 2. Cardiac functions of heart failure rats in the cold environment before and 2 weeks after cardiomyocyte transplantation detected by echocardiogram. Group I: transplanted with microRNA-21-transfected cardiomyocytes; group II: transplanted with untransfected cardiomyocytes; group III: transplanted with DMEM.

    圖2心臟彩超檢測心肌細(xì)胞移植前和移植2周后低溫心衰大鼠的心功能

    表1低溫心衰大鼠心肌細(xì)胞移植前和移植2周后心功能各指標(biāo)的變化

    Table 1. The changes of cardiac functions of heart failure rats in the cold environment before and 2 weeks after cardiomyocyte transplantation (mean±SD)

    ParameterGroupnBeforetransplantationAftertransplantationΔ(after-before)LVIDd(mm)I95.58±0.124.72±0.18*-0.86±0.15#△II85.61±0.164.99±0.11*-0.62±0.14#III75.64±0.135.52±0.17-0.12±0.15LVIDs(mm)I93.87±0.162.71±0.12*-1.16±0.14#△II83.92±0.122.99±0.14*-0.93±0.13#III73.90±0.193.89±0.18-0.01±0.18EF(%)I962.28±1.1878.11±1.01*15.83±1.09#△II862.14±1.2372.02±1.22*9.88±1.22#III762.19±1.0561.16±1.17-1.03±1.12FS(%)I929.12±1.2135.36±1.51*6.64±1.37#△II828.87±1.1434.16±1.45*5.29±1.30#III729.31±1.0229.34±1.130.08±1.01

    LVIDd: left ventricular internal dimension at end-diastole; LVIDs: left ventricular internal dimension at end-systole; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening. Group I: transplanted with microRNA-21-transfected cardiomyocytes; group II: transplanted with untransfected cardiomyocytes; group III: transplanted with DMEM.*P<0.05vsbefore transplantation;#P<0.05vsgroup III;△P<0.05vsgroup II.

    3各組心肌組織的病理表現(xiàn)

    3.1心力衰竭動物模型 光鏡下可見常溫條件下正常組和低溫條件下正常組心肌細(xì)胞形態(tài)、胞質(zhì)、間質(zhì)及橫(縱)紋均為正常;常溫條件下心力衰竭組存在心肌細(xì)胞橫(縱)紋不清, 部分區(qū)域肌質(zhì)纖維溶解, 胞漿空泡變性, 不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤和間質(zhì)水腫病變表現(xiàn);低溫條件下心力衰竭組的病變較常溫條件下心力衰竭組明顯嚴(yán)重,見圖3。

    3.2用于細(xì)胞移植的低溫條件下心力衰竭動物模型 病理切片HE染色顯示植入的心肌細(xì)胞體積較小, 核漿比例明顯增大, 表現(xiàn)出幼稚細(xì)胞的特征。I組和II組較III組病理改變(肌質(zhì)纖維溶解、胞漿空泡變性、炎癥細(xì)胞浸潤和間質(zhì)水腫病變)明顯減輕,尤以I組減輕得更明顯, 提示移植單純心肌細(xì)胞組和移植轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞組較移植DMEM培養(yǎng)基組心肌病理改變明顯改善,尤以移植轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞組更明顯,見圖4。

    4TUNEL檢測各組心肌組織的凋亡率

    光鏡下常溫條件下正常組和低溫條件下正常組偶見TUNEL陽性細(xì)胞,常溫條件下心力衰竭組可見明顯TUNEL染色陽性細(xì)胞, 低溫條件下心力衰竭組可見更多TUNEL染色陽性細(xì)胞,見圖5。常溫條件下心力衰竭組和低溫條件下心力衰竭組凋亡指數(shù)分別為28.79±3.10和23.56±2.20, 均顯著高于常溫條件下正常組和低溫條件下正常組的3.56±1.21和4.21±0.88(P<0.05), 常溫條件心衰組凋亡指數(shù)又顯著低于低溫條件下心力衰竭組(P<0.05)。常溫條件下正常組和低溫條件下正常組凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果提示常溫正常組和低溫正常組無明顯心肌組織凋亡,常溫心衰組心肌凋亡明顯,低溫心衰組心肌凋亡更明顯。

    Figure 3. Pathological changes of myocardial tissues from heart failure rats in the normal or cold environment (HE staining, scale bar=20 μm). Group a: normal rats in the normal environment; group b: normal rats in the cold environment; group c: heart failure rats in the normal environment; group d: heart failure rats in the cold environment.

    圖3HE染色檢測正常或低溫條件下心衰大鼠心肌組織的病理變化

    Figure 4. Pathological changes of myocardial tissues from heart failure rats in the cold environment 2 weeks after cardiomyocyte transplantation (HE staining, scale bar=20 μm). Group I: transplanted with microRNA-21-transfected cardiomyocytes; group II: transplanted with untransfected cardiomyocytes; group III: transplanted with DMEM.

    圖4HE染色檢測心肌細(xì)胞移植2周后低溫心衰大鼠心肌組織的病理變化

    Figure 5. Apoptosis of myocardial tissues from heart failure rats in the normal or cold environment (TUNEL, scale bar=20 μm). Group a: normal rats in the normal environment; group b: normal rats in the cold environment; group c: heart failure rats in the normal environment; group d: heart failure rats in the cold environment. Arrows indicate apoptotic cells.

    圖5TUNEL法檢測正?;虻蜏貤l件下心衰大鼠心肌組織的凋亡情況

    5MicroRNA-21的相對表達(dá)量

    5.1心力衰竭動物模型 各樣本反應(yīng)達(dá)到預(yù)設(shè)熒光信號時(shí),常溫條件下正常組microRNA-21和內(nèi)參照U6的循環(huán)數(shù)分別為21.63±0.04和14.27±0.02,低溫條件下正常組分別為23.71±0.05和16.69±0.06,常溫條件下心力衰竭組分別為28.91±0.02和15.73±0.05,低溫條件下心力衰竭組分別為29.88±0.06和16.52±0.03。2-ΔΔCt法分析結(jié)果顯示,與常溫件下正常組相比, 低溫條件下正常組的microRNA-21的表達(dá)量下調(diào), 約0.5倍(P<0.05);常溫條件下心力衰竭組的microRNA-21的表達(dá)量明顯下調(diào), 約1/16倍(P<0.05);低溫條件下心力衰竭組的microRNA-21的表達(dá)量下調(diào)更明顯, 約1/32(P<0.05),見圖6。

    5.2細(xì)胞移植 正常心肌細(xì)胞組microRNA-21和U6循環(huán)數(shù)分別為33.65±0.18和21.43±0.63, 轉(zhuǎn)染了過表達(dá)microRNA-21的重組慢病毒載體的心肌細(xì)胞組分別為30.71±0.47和26.51±0.43。2-ΔΔCt法分析結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染了過表達(dá)microRNA-21重組慢病毒表達(dá)載體的心肌細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05), 約3倍,見圖7。

    6移植的心肌細(xì)胞的存活情況

    I組和II組心肌組織抗BrdU免疫組化染色顯示心肌細(xì)胞胞漿淡染, 宿主心肌細(xì)胞胞核較細(xì)長, 呈深藍(lán)色,移植的乳鼠心肌細(xì)胞胞核多呈卵圓形, 棕褐色,提示移植的心肌細(xì)胞在低溫條件下心力衰竭大鼠的心肌組織中能存活,見圖8。

    Figure 6. The expression of microRNA-21 in myocardial tissues from heart failure rats in the normal or cold environment detected by qRT-PCR. Group a: normal rats in the normal environment; group b: normal rats in the cold environment; group c: heart failure rats in the normal environment; group d: heart failure rats in the cold environment. Mean±SD.*P<0.05vsgroup a;#P<0.05vsgroup b;△P<0.05vsgroup c.

    圖6qRT-PCR檢測正?;虻蜏貤l件下心衰大鼠心肌組織中microRNA-21的表達(dá)

    Figure 7. The expression of microRNA-21 in cardiomyocytes in microRNA-21 transfection group and control group detected by qRT-PCR.Mean±SD.*P<0.05vscontrol group.

    圖7qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)

    Figure 8. Survival of cardiomyocytes transplanted into myocardial tissues of heart failure rat in the cold environment (immunohistochemical staining for BrdU, scale bar=20 μm). Group I: transplanted with microRNA-21-transfected cardiomyocytes; group II: transplanted with untransfected cardiomyocytes. The cytoplasm of cardiomyocytes was stainless, while the nuclei of transplanted cardiomyocytes were ovate and stained in brown (arrows).

    圖8抗BrdU免疫組化染色法檢測低溫心衰大鼠心肌組織中移植的心肌細(xì)胞的存活情況

    討 論

    心力衰竭(心衰)仍是目前導(dǎo)致死亡和致殘的主要原因,每年死亡率高達(dá)7.2%。當(dāng)今社會隨著生態(tài)環(huán)境的不斷被破壞,極端氣候已經(jīng)成為21世紀(jì)危害人類健康的第一殺手,成為心臟疾病患者誘發(fā)心衰的主要因素之一[12]。然而目前對于低溫條件下心力衰竭的研究尚未在國內(nèi)外完全開展。本研究通過利用阿霉素及氣候箱模擬構(gòu)建低溫條件下心力衰竭模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫對正常大鼠的心功能及心肌細(xì)胞凋亡率無明顯影響,但對心衰大鼠具有明顯影響,能明顯降低心功能及增加心肌細(xì)胞凋亡率,故本研究以低溫條件下心力衰竭大鼠模型作為研究基石,以尋找治療低溫條件下心力衰竭的有效基因及探討相關(guān)機(jī)制。

    本研究通過利用qRT-PCR檢測常/低溫條件下正常大鼠及心力衰竭大鼠心肌組織中的microRNA-21的表達(dá),結(jié)果顯示microRNA-21對阿霉素和低溫都敏感。阿霉素能明顯下調(diào)心肌組織中microRNA-21的表達(dá),提示microRNA-21可能參與氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的心血管疾病如心力衰竭的病理生理過程;在低溫條件下的大鼠模型中,低溫條件能更明顯下調(diào)心肌組織中microRNA-21的表達(dá),提示microRNA-21可能參與低溫條件下的心血管疾病如低溫條件下心力衰竭的病理生理過程??偠灾?在低溫條件下心力衰竭大鼠心肌組織中microRNA-21明顯下調(diào),與心肌組織凋亡程度及心功能呈負(fù)相關(guān),揭示microRNA-21可能是保護(hù)性因子,故本研究通過心肌細(xì)胞移植及慢病毒轉(zhuǎn)染法上調(diào)低溫條件下心力衰竭大鼠心肌組織中microRNA-21的表達(dá)以達(dá)到治療作用。

    隨著基礎(chǔ)和臨床研究的不斷開展,細(xì)胞移植治療心力衰竭已取得了很大的進(jìn)展[13-14]。心肌細(xì)胞移植治療時(shí),所移植的細(xì)胞必須能到達(dá)心臟受損部位并在疤痕組織存活、分化;移植或分化后的細(xì)胞需具有收縮能力,并和疤痕外的自身心肌細(xì)胞形成有效細(xì)胞縫隙連接及電生理偶聯(lián)。目前大量動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌細(xì)胞移植于宿主心肌組織中不僅能存活,并且能與宿主心肌組織建立縫隙連接并改善宿主心功能。然而單純的細(xì)胞移植有一定的局限性,移植細(xì)胞的存活與進(jìn)一步分化成熟很大程度上決定了心功能的改善程度[15]。而衰竭的心肌組織不利于細(xì)胞生存,降低了移植效果。因此近年來有學(xué)者將microRNA與細(xì)胞移植聯(lián)合進(jìn)行注射,發(fā)現(xiàn)能更良好地改善心功能[10]。Sayed等[6]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)microRNA-21的轉(zhuǎn)基因大鼠能抑制PTEN及FasL的表達(dá)上調(diào),縮小梗死面積及減輕心衰的進(jìn)展。本研究將過表達(dá)microRNA-21的心肌細(xì)胞移植于低溫條件下心力衰竭大鼠的心肌組織中,顯著改善了衰竭心肌組織的心功能。本研究選擇出生24 h內(nèi)的乳鼠心肌細(xì)胞為研究對象,抗BrdU免疫組化結(jié)果顯示大部分移植細(xì)胞抗BrdU染色呈陽性,提示移植的乳鼠心肌細(xì)胞在宿主衰竭的心肌組織中大部分能存活,其中部分具有復(fù)制及分裂增生能力。心臟彩超結(jié)果顯示,在單純心肌細(xì)胞移植組,細(xì)胞移植后其左室前壁厚度增厚,左室舒張末期容積減小,與單純DMEM培養(yǎng)基移植組相比有明顯差異,說明抑制心室擴(kuò)大及重構(gòu)的主要因素在于移植細(xì)胞對瘢痕組織的替代作用和細(xì)胞性心肌塑形作用。在lenti-microRNA-21轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞移植組,心功能的改善優(yōu)于單純心肌細(xì)胞移植組,左室舒張末期容積減小及室壁厚度增厚更明顯,進(jìn)一步說明心功能的改善有利于移植細(xì)胞的存活,提高了移植存活細(xì)胞數(shù)量,而存活的移植細(xì)胞防止了瘢痕區(qū)進(jìn)一步擴(kuò)張,從而抑制了宿主心室重構(gòu)。HE染色病理切片也證實(shí)移植單純心肌細(xì)胞及轉(zhuǎn)染了過表達(dá)microRNA-21的重組慢病毒表達(dá)載體的心肌細(xì)胞后能減輕宿主心肌組織病理改變,其中以后者更顯著,這對于移植心肌細(xì)胞的存活是至關(guān)重要的。總而言之, 新生乳鼠心肌細(xì)胞移植能夠在宿主大鼠心肌組織中存活并改善其心功能;轉(zhuǎn)染了microRNA-21的心肌細(xì)胞更能夠明顯改善宿主心功能,從而揭示microRNA-21可能在未來治療低溫條件下的心力衰竭中發(fā)揮重要的作用。

    在移植實(shí)驗(yàn)中,移植單純培養(yǎng)基組移植后有3只大鼠死亡,可能與低溫條件下心力衰竭大鼠心功能差導(dǎo)致大鼠不能承受開胸有關(guān)。在移植后,移植心肌細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)染組)的2組共計(jì)3只大鼠死亡,可能與持續(xù)應(yīng)用免疫抑制劑有關(guān)。因此,如何選擇合適的免疫抑制劑治療劑量和療程還有待進(jìn)一步研究。

    [1] Feldman DE, Platt R, Déry V, et al. Seasonal congestive heart failure mortality and hospitalization trends, Quebec 1990-1998 [J].J Epidemiol Community Health, 2004, 58(2): 129-130.

    [2] Sun Z. Cardiovascular responses to cold exposure [J]. Front Biosci (Elite Ed), 2010, 2: 495-503.

    [3] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004, 116(2):281-297.

    [4] Pushparaj PN, Aarthi JJ, Kumar SD, et al. RNAi and RNAa: the Yin and Yang of RNAome [J].Bioinformation,2008,2(6):235-237.

    [5] Roy S, Khanna S, Hussain SR, et al. MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction: miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue [J]. Cardiovas Res, 2009, 82(1):21-29.

    [6] Sayed D, He M, Hong C, et al. MicroRNA-21 is a downstream effector of AKT that mediates its anti-apoptotic effects via suppression of Fas ligand [J]. J Biol Chem, 2010, 285(26): 20281-20290.

    [7] Biggar KK, Dubuc A, Storey K. MicroRNA regulation below zero:differential expression of miRNA-21 and miRNA-16 during freezing in wood frogs[J]. Cryobiology, 2009, 59(3): 317-321.

    [8] Yin C, Wang X, Kukreja RC. Endogenous microRNAs induced by heat-shock reduce myocardial infarction following ischemia-reperfusion in mice [J]. FEBS Lett, 2008, 582(30): 4137-4142.

    [9] Gammell P, Barron N, Kumar N, et al. Initial identification of low temperature and culture stage induction of miRNA expression in suspension CHO-K1 cells[J]. J Biotechnol, 2007, 130(3): 213-218.

    [10]de Muinck ED. Gene and cell therapy for heart failure [J]. Antioxid Redox Signal, 2009, 11(8): 2025-2042.

    [11]Li S, Liang Z, Xu L, et al. MicroRNA-21: a ubiquitously expressed pro-survival factor in cancer and other diseases [J]. Mol Cell Biochem, 2012, 360(1-2):147-158.

    [12]Cohn JN, Bristow MR, Chien KR, et al. Report of the National Heart, Lung and Blood Institute. Special Emphasis Panel on Heart Failure Research [J].Circulation, 1997, 95(4):766-770.

    [13]張 勇,蔡振杰,陳如坤.自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔缺血心肌的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國病理生理雜志,2005,21(2):356-360.

    [14]蒙艷斌,賀莉萍,錢海燕.胚胎干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死后心肌病理形態(tài)學(xué)及血流動力學(xué)變化[J].中國病理生理雜志,2005,21(3):601-603.

    [15]郎明建,曾秋棠,關(guān)思虞,等. 血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞移植對心肌梗死大鼠心功能的影響[J].中國病理生理雜志,2006,22(9):1684-1688.

    EffectofmicroRNA-21-transfectedcardiomyocytetransplantationonheartfailureratsunderlow-temperaturecondition

    TANG Yan1,2, WANG Meng-hong1

    (1DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofNanhuaUniversity,Hengyang421001,China.E-mail:wmh666888@sina.com)

    AIM: To investigate the effects of microRNA-21 on heart failure rats under the low-temperature condition.METHODSThe rat model of heart failure was constructed by injection of adriamycin and the rats were placed in a climate box. The cardiac functions, the apoptotic index and pathological changes of the myocardium were determined. The expression of microRNA-21 in the myocardium of the rats was detected by qRT-PCR. Neonatal cardiomyocytes were culturedinvitro, labeled with BrdU and transferred with lenti-microRNA-21 by DNA transfection. The heart failure rats in the cold environment were randomly divided into 3 groups: the rats in group I were transplanted with lenti-microRNA-21-transfected neonatal cardiomyocytes, the rats in group II were transplanted with untransfected cardiomyocytes and the rats in group III were transplanted with culture medium into the failure myocardium. The echocardiography was applied to evaluate the heart functions. The rats were then executed and the hearts were harvested for histological (HE staining) and immunohistological (anti-BrdU staining) examinations.RESULTSThe cardiac functions of the heart failure rats in the cold environment (group d) were significantly worse than those in the normal environment (group c). The cardiac functions in group c were significantly worse than those in the normal rats in the normal environment (group a). No obvious difference of the cardiac functions between group a and group b (the normal rats in the cold environment) was observed. The apoptotic index of the myocardium in group d was significantly higher than that in group c, and that in group c was significantly higher than that in group a. No obvious difference of the apoptotic index of myocardium between group a and group b was found. The expression level of microRNA-21 in the myocardium in group c was significantly lower than that in group a, that in group d was lower than that in group c, and that in group b was also lower than that in group A. The expression of microRNA-21 in the transfected groups was higher than that in untransfected groups. Improvement of ejection fraction (EF) in group I and group II was greater than that in group III. The transplanted cardiomyocytes survived in the failure myocardium. The pathological changes of the myocardium in group I and group II were improved as compared with those in group III. The cardiac functions and pathological improvement in the myocardium were better in group I than those in group II.CONCLUSIONTransplantation of microRNA-21-transfected cardiomyocytes into the myocardium of heart failure rats under the low-temperature condition improves the cardiac functions and relieves the pathological changes.

    Heart failure; Cardiomyocytes; MicroRNA-21; Transplantation

    R363

    A

    10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.001

    1000-4718(2013)01-0001-08

    2012-03-27

    2012-10-29

    國家科技支撐計(jì)劃(No.2008BAI68BA02)

    △通訊作者 Tel: 0791-88692501; E-mail:wmh666888@sina.com

    猜你喜歡
    常溫心肌細(xì)胞心衰
    滲透固結(jié)型環(huán)氧樹脂基油氣井常溫固泥材料
    國外心衰患者二元關(guān)系的研究進(jìn)展
    左歸降糖舒心方對糖尿病心肌病MKR鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響
    睡眠質(zhì)量與心衰風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)
    中老年保健(2021年2期)2021-12-02 00:50:10
    活血解毒方對缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞凋亡的影響
    常溫發(fā)黑工藝在軸承工裝上的應(yīng)用
    哈爾濱軸承(2021年1期)2021-07-21 05:43:14
    討論每天短時(shí)連續(xù)透析治療慢性腎臟病合并心衰
    常溫磷化工藝技術(shù)漫談
    心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的研究進(jìn)展
    槲皮素通過抑制蛋白酶體活性減輕心肌細(xì)胞肥大
    各种免费的搞黄视频| 老司机影院成人| av一本久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 日本91视频免费播放| 欧美人与善性xxx| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲国产av新网站| 日日爽夜夜爽网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久国产精品麻豆| 大香蕉久久成人网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 成人午夜精彩视频在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一区在线观看完整版| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 五月天丁香电影| 91成人精品电影| 国产成人精品在线电影| 亚洲综合色惰| 99久久精品国产国产毛片| 乱人伦中国视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲国产精品999| 日韩一本色道免费dvd| 在线观看三级黄色| 国产精品熟女久久久久浪| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品酒店卫生间| av网站免费在线观看视频| 777米奇影视久久| 我要看黄色一级片免费的| 伊人久久国产一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 99热网站在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 午夜福利视频在线观看免费| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲欧洲日产国产| 麻豆乱淫一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黄片无遮挡物在线观看| 天美传媒精品一区二区| 国产69精品久久久久777片| 宅男免费午夜| 一区二区三区精品91| 国产片内射在线| 国产成人aa在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 边亲边吃奶的免费视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 麻豆乱淫一区二区| 久久久久国产网址| www.色视频.com| av卡一久久| 成年av动漫网址| 免费大片黄手机在线观看| 一区在线观看完整版| 久久青草综合色| 婷婷成人精品国产| videosex国产| 黑人高潮一二区| 亚洲欧美清纯卡通| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av日韩在线播放| 在线观看三级黄色| 亚洲国产色片| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 男女国产视频网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产不卡av网站在线观看| 国产黄色免费在线视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 另类精品久久| 久久国产精品大桥未久av| 女人精品久久久久毛片| 丝袜脚勾引网站| 国产av一区二区精品久久| 男女啪啪激烈高潮av片| 成人漫画全彩无遮挡| 国产69精品久久久久777片| 不卡视频在线观看欧美| 桃花免费在线播放| 人妻少妇偷人精品九色| 国产毛片在线视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产亚洲最大av| 国产乱来视频区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 最近手机中文字幕大全| 亚洲国产看品久久| av播播在线观看一区| 久久精品久久精品一区二区三区| 如何舔出高潮| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲综合色网址| 国产 精品1| 18+在线观看网站| 日本av免费视频播放| 中文字幕最新亚洲高清| 青春草国产在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | xxx大片免费视频| 人妻少妇偷人精品九色| 大香蕉久久网| 亚洲国产欧美在线一区| 激情视频va一区二区三区| 九草在线视频观看| 黑人高潮一二区| 水蜜桃什么品种好| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 成年动漫av网址| 国产极品天堂在线| 美女内射精品一级片tv| 日韩一区二区视频免费看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 黄色怎么调成土黄色| 韩国精品一区二区三区 | 少妇人妻精品综合一区二区| 99国产精品免费福利视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩免费高清中文字幕av| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 免费黄网站久久成人精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美性感艳星| 国产色爽女视频免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久ye,这里只有精品| 国产精品久久久久久精品古装| 女人久久www免费人成看片| 七月丁香在线播放| 日韩一区二区三区影片| 最近中文字幕2019免费版| 在线观看三级黄色| 丝袜在线中文字幕| 满18在线观看网站| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲美女黄色视频免费看| 高清不卡的av网站| 精品一品国产午夜福利视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩制服骚丝袜av| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久久精品人妻al黑| 色吧在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲内射少妇av| 亚洲精品中文字幕在线视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 午夜久久久在线观看| 在线观看www视频免费| 欧美最新免费一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 久久精品国产亚洲av天美| 国产免费一级a男人的天堂| 制服人妻中文乱码| 欧美成人午夜免费资源| 国产黄频视频在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 日韩在线高清观看一区二区三区| 黑人高潮一二区| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费高清在线观看日韩| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产又爽黄色视频| 99热国产这里只有精品6| 久久国内精品自在自线图片| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲内射少妇av| 晚上一个人看的免费电影| 精品熟女少妇av免费看| 国产成人免费无遮挡视频| 免费少妇av软件| 一区二区三区精品91| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品人妻在线不人妻| 男人操女人黄网站| 亚洲国产精品成人久久小说| 波野结衣二区三区在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久婷婷青草| 少妇人妻久久综合中文| 欧美3d第一页| 美女大奶头黄色视频| av在线播放精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲美女黄色视频免费看| 又黄又粗又硬又大视频| av有码第一页| 免费大片18禁| 人妻 亚洲 视频| 99热国产这里只有精品6| 久久久久精品性色| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 激情五月婷婷亚洲| 999精品在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日本色播在线视频| 亚洲人与动物交配视频| 精品熟女少妇av免费看| 99久久综合免费| 两个人免费观看高清视频| 免费在线观看黄色视频的| 久久久久网色| 精品国产露脸久久av麻豆| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜免费观看性视频| 人人妻人人澡人人看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 香蕉丝袜av| 欧美性感艳星| 国产色婷婷99| 亚洲av.av天堂| 一二三四在线观看免费中文在 | 91在线精品国自产拍蜜月| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 69精品国产乱码久久久| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产1区2区3区精品| 考比视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 1024视频免费在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一级毛片电影观看| 日日啪夜夜爽| 国产 一区精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| videosex国产| 久久97久久精品| 考比视频在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日日撸夜夜添| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 超色免费av| 国产亚洲精品久久久com| 捣出白浆h1v1| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产又爽黄色视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 妹子高潮喷水视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 毛片一级片免费看久久久久| 91精品三级在线观看| 一级a做视频免费观看| 99久久人妻综合| 国产精品成人在线| 亚洲人与动物交配视频| 中文天堂在线官网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产一区二区三区综合在线观看 | 伦理电影大哥的女人| 中国国产av一级| 欧美97在线视频| 久久这里只有精品19| 超碰97精品在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产在视频线精品| 国产成人精品在线电影| 国产免费视频播放在线视频| www.av在线官网国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 赤兔流量卡办理| 大码成人一级视频| 国产色爽女视频免费观看| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲av中文av极速乱| 女性被躁到高潮视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 视频中文字幕在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美bdsm另类| 国产成人欧美| 91aial.com中文字幕在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| av.在线天堂| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产成人一区二区在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 97超碰精品成人国产| 色哟哟·www| 午夜福利视频在线观看免费| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产乱来视频区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人精品无人区| 有码 亚洲区| 久久久久久久亚洲中文字幕| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人欧美| 99香蕉大伊视频| 妹子高潮喷水视频| 日本av免费视频播放| 国产日韩欧美视频二区| 18在线观看网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲av日韩在线播放| 婷婷色综合www| 国产免费现黄频在线看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品卡一卡二卡四卡免费| 大香蕉久久网| 男男h啪啪无遮挡| 国产在线视频一区二区| xxxhd国产人妻xxx| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产熟女欧美一区二区| 性色avwww在线观看| 成人免费观看视频高清| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99国产综合亚洲精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 18禁国产床啪视频网站| 青春草亚洲视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 看免费成人av毛片| 在线观看免费高清a一片| 免费大片黄手机在线观看| 看免费av毛片| 久久久久精品人妻al黑| 久久 成人 亚洲| 日本黄色日本黄色录像| 一区二区三区四区激情视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美性感艳星| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久人妻熟女aⅴ| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线天堂最新版资源| 精品国产国语对白av| 亚洲经典国产精华液单| 久久午夜福利片| 久久久国产精品麻豆| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 91精品国产国语对白视频| 在线天堂中文资源库| 日韩成人av中文字幕在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| av国产精品久久久久影院| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲一码二码三码区别大吗| 五月天丁香电影| 永久免费av网站大全| av女优亚洲男人天堂| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩一区二区三区影片| 一区在线观看完整版| 欧美日韩亚洲高清精品| 观看av在线不卡| 中文字幕制服av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 少妇精品久久久久久久| 一级片'在线观看视频| 成年动漫av网址| 欧美国产精品一级二级三级| 国产毛片在线视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 午夜91福利影院| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产 一区精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇人妻 视频| av黄色大香蕉| 国产精品人妻久久久影院| 天天影视国产精品| √禁漫天堂资源中文www| 少妇的逼水好多| 搡老乐熟女国产| 亚洲性久久影院| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品无大码| 久久久久久久大尺度免费视频| 一区二区av电影网| 久久久a久久爽久久v久久| 一级片'在线观看视频| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 日韩电影二区| 久久热在线av| 伦理电影大哥的女人| 一级毛片我不卡| 国产福利在线免费观看视频| 人妻系列 视频| 国产精品无大码| 久久久久久人妻| 99久久中文字幕三级久久日本| 精品一区二区三卡| 久久久久人妻精品一区果冻| 大香蕉久久网| 大香蕉97超碰在线| 欧美精品一区二区大全| 久久精品夜色国产| 日本午夜av视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲国产最新在线播放| 精品福利永久在线观看| 国产精品一二三区在线看| 久久精品国产自在天天线| videos熟女内射| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产av国产精品国产| 久久女婷五月综合色啪小说| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品视频女| 蜜桃国产av成人99| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲经典国产精华液单| 老司机亚洲免费影院| 男女边摸边吃奶| 亚洲成人一二三区av| 成人国产麻豆网| 国产日韩欧美在线精品| 久久热在线av| 黑丝袜美女国产一区| 免费日韩欧美在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 女人精品久久久久毛片| 99香蕉大伊视频| 国产乱人偷精品视频| 亚洲成国产人片在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 青春草亚洲视频在线观看| 女人久久www免费人成看片| 99久国产av精品国产电影| 亚洲精品视频女| 三上悠亚av全集在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 精品人妻在线不人妻| 久久青草综合色| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 丝袜脚勾引网站| 男人操女人黄网站| tube8黄色片| 中文字幕最新亚洲高清| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲国产精品成人久久小说| 免费观看a级毛片全部| 精品人妻一区二区三区麻豆| 男女国产视频网站| 久久精品人人爽人人爽视色| 97人妻天天添夜夜摸| 国产一区二区三区av在线| 亚洲国产精品国产精品| 男女边吃奶边做爰视频| 国产一区二区激情短视频 | 日本欧美视频一区| 久久影院123| 女人久久www免费人成看片| 五月天丁香电影| 国产精品一国产av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 一级片'在线观看视频| 国产成人一区二区在线| 亚洲综合精品二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 成人国产av品久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 人人妻人人澡人人看| 精品一品国产午夜福利视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产有黄有色有爽视频| 韩国高清视频一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 免费在线观看完整版高清| 丰满少妇做爰视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 乱人伦中国视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 九草在线视频观看| 9热在线视频观看99| 69精品国产乱码久久久| 美女中出高潮动态图| av国产精品久久久久影院| 满18在线观看网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产男女内射视频| 黄色配什么色好看| 黄色视频在线播放观看不卡| 少妇人妻 视频| 久久久精品免费免费高清| 卡戴珊不雅视频在线播放| 22中文网久久字幕| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲经典国产精华液单| 免费黄色在线免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久欧美国产精品| 成人无遮挡网站| 国产黄色免费在线视频| 男女午夜视频在线观看 | 欧美日韩综合久久久久久| 人妻系列 视频| 我的女老师完整版在线观看| 深夜精品福利| 久久国内精品自在自线图片| 哪个播放器可以免费观看大片| 老女人水多毛片| 天堂8中文在线网| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲av综合色区一区| 亚洲成国产人片在线观看| 91精品三级在线观看| 女性被躁到高潮视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 日本黄色日本黄色录像| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 草草在线视频免费看| 亚洲精品一二三| 一本大道久久a久久精品| 成人黄色视频免费在线看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产成人精品无人区| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99视频精品全部免费 在线| 另类精品久久| 一边亲一边摸免费视频| 五月开心婷婷网| 少妇 在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美人与善性xxx| 精品一区二区三区视频在线| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品国产av在线观看| 午夜91福利影院| 国产一区二区三区av在线| 男女无遮挡免费网站观看| 丝袜美足系列| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一级爰片在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 日韩一本色道免费dvd| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产精品久久久久久久电影| 欧美成人精品欧美一级黄| 一级毛片电影观看| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品蜜桃在线观看| 夫妻午夜视频| 在线天堂最新版资源| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 天堂中文最新版在线下载| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产视频首页在线观看| 永久网站在线| 成年av动漫网址| 欧美性感艳星| 中文天堂在线官网| 男女午夜视频在线观看 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久久人妻| 9色porny在线观看| 天天操日日干夜夜撸| av黄色大香蕉| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩|