三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油成分及抑菌活性研究

解修超，陳文強，鄧百萬，彭浩，劉兆迪，阮昌應

(1.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000;2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000)

0 引言

植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指生活在植物體內(nèi)或生活史的一定階段處于植物體內(nèi)的真菌。研究表明某些抗癌藥用植物中個別內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分，已日漸引起科研工作者的注意。從微生物，特別是從植物內(nèi)生真菌中尋找有抗癌、抗菌活性的成分對獲得更多的天然產(chǎn)物，對保護生物多樣性具有重大意義。因真菌等微生物除了種類多、資源豐富外，還有生長繁殖快、易培養(yǎng)、易控制、代謝能力強、產(chǎn)量高、成本低，不受季節(jié)、氣候和地域的限制，便于組織大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，并可通過誘變育種等手段來提高菌種性能等優(yōu)點。這使工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)抗癌、抗菌藥物成為可能，其發(fā)展?jié)摿薮骩1-3]。

三尖杉(Cephalotaxus fortunei)為三尖杉科三尖杉屬植物，分布于我國陜西南部、甘肅南部、華東、華南、西南地區(qū)，散生于海拔800～2000 m的山林邊緣、路旁及山澗潮濕地帶。該植物在陜西境內(nèi)主要分布于秦嶺南坡和巴山地區(qū)的鎮(zhèn)巴、佛坪、留壩、略陽、勉縣、旬陽、石泉、寧陜等縣[4-5]。從其根、樹皮、種子等部位中提取的多種生物堿被臨床證明是有效的抗癌藥物，特別是在白血病治療方面具有較高的藥用價值和潤肺、止咳、消積、殺蟲等功效[6-9]。由于植株生長緩慢，加之人類對天然藥物需求量的逐年增加，導致三尖杉資源急劇減少。本研究以分離自秦巴山區(qū)三尖杉的內(nèi)生真菌SR1-26為材料，通過GC-MS技術(shù)分析了其揮發(fā)油的化學成分，并初步研究了揮發(fā)油的抗菌活性，以期為三尖杉內(nèi)生真菌資源的開發(fā)與利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料

(1)內(nèi)生菌菌株。三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心從三尖杉根部的健康組織分離獲得。三尖杉種子樣品采自陜西省漢臺區(qū)褒河森林公園三尖杉野生植株。內(nèi)生真菌SR1-26經(jīng)顯微觀察初步鑒定為鐮孢菌屬(Fusarium sp.)真菌，保存于陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心。

(2)靶標菌株。大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella typhl)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、白色念珠菌(Monilia albican)，購自美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)，由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GS6890N/MSD5973N，美國安捷倫科技有限公司)，高級研究顯微鏡(E600，日本Nikon公司)，酶標分析儀(RT-2100C，深圳雷杜公司)，數(shù)顯式恒溫培養(yǎng)箱(LRH-250-GS，廣東省醫(yī)療器械廠)。

試驗用分析純試劑(乙醚、二甲基亞砜等)購自天津科密歐公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三尖杉內(nèi)生真菌的培養(yǎng)

從保藏的試管斜面挑取適量SR1-26菌種，接種于PDA平板上活化，在菌落邊緣取直徑3 mm的菌塊，轉(zhuǎn)入裝有300 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。

1.2.2 揮發(fā)油的提取

收集SR1-26發(fā)酵液，經(jīng)抽濾得到菌絲體，用無菌水清洗3次，冷凍干燥后備用。稱重，菌絲體粉末用濾紙包裝，置于索氏提取器中，加入適量乙醚，加熱至40℃，回流提取12 h，同溫回收乙醚得油狀物，稱重，計算得率。采用氫氧化鉀-甲醇酯化法對樣品做酯化處理，得GC-MS檢測用樣品[8-9]。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜檢測

色譜柱:美國J＆W.HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱。程序升溫:以5℃/min的升溫速率由50℃程序升溫至290℃，恒溫保持20 min。GC氣化室溫度為250℃，載氣為99.999%高純度氦，流速2.0 mL/min。質(zhì)譜條件:離子源為EI源，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230℃。倍增電壓1.28 kV，質(zhì)量掃描范圍為10～550 aum，掃描速度3.8次/s。

1.2.4 抗菌活性檢測

采用濾紙片擴散法[10]測定樣品對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的抑制作用。取適量揮發(fā)油原液，分別配制成濃度為1000.0，100.0，10.0和1.0 mg/mL的樣品溶液，各加入適量過氧化氫酶，用于消除可能帶來的活性影響。將直徑為8.0 mm的無菌濾紙片置于各濃度樣品的上清液中浸濕，待溶劑揮干后貼在涂有100.0 μL靶標菌懸液(菌液濃度為0.8×106～1.2×106CFU/mL)的培養(yǎng)基平板上，重復3次，細菌選用NA培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h;真菌采用YPD培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，分別測量各濃度樣品在不同靶標菌平板上的抑菌圈直徑。以含有過氧化氫酶的乙醚溶液作為空白對照，操作步驟與試驗組相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油的提取率

內(nèi)生真菌SR1-26發(fā)酵液1.8 L，過濾干燥得菌絲體10.30 g。以乙醚作為溶劑，采用索氏提取法經(jīng)12 h回流提取，得到淡黃色透明油狀揮發(fā)油1.40 g，其具有特殊香味，密度小于水，經(jīng)計算得率為13.59%。

2.2 三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油的化學成分與含量

通過對三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油成分進行氣相色譜-質(zhì)譜檢測，得到GC-MS分析總離子流圖。檢索美國NIST02L和WILEY275標準質(zhì)譜圖庫確認其成分，運用峰面積歸一化法，借助G170LBA化學工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，求得各揮發(fā)油成分的相對含量，結(jié)果見表1。

表1 三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油成分及含量

表1結(jié)果顯示，從三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26的揮發(fā)油樣品中共檢出22種成分，經(jīng)多重比對鑒定了其中的18種化學成分，占總油量的98.01%，主要成分為脂肪酸類及部分脂肪烷烴和烯醛類物質(zhì)。主要包括油酸(58.61%)、棕櫚酸(10.06%)、油酸乙酯(12.05%)、硬脂酸(4.55%)、棕櫚酸乙酯(2.48%)、3-甲基-2-戊酮肟(1.85%)、3，3-二氯-1，1，2，2-四甲基環(huán)丙烷(1.53%)、(Z)-2-癸烯醛(1.35%)、1，2，3，6-甲基雙環(huán)[2.2.2]辛烷(1.20%)等成分。

2.3 三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油的抑菌活性

以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等4種細菌和白色念珠菌病原真菌作為靶標菌株，采用濾紙片擴散法對揮發(fā)油進行抑菌活性檢測。實驗結(jié)果表明，各濃度梯度的揮發(fā)油均表現(xiàn)出了不同程度的抗菌活性，結(jié)果見表2。

表2結(jié)果顯示，三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌3種靶標細菌有較強的抑制活性，不同濃度的抑制效果具有明顯差異。其中揮發(fā)油濃度為1000.0 mg/mL時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達21.0 mm 和19.5 mm，在濃度降低至10.0 mg/mL時，依然存在抑制活性。揮發(fā)油對沙門氏菌也顯示一定的抑制活性;高濃度揮發(fā)油對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌表現(xiàn)較弱的活性。

表2 三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油對靶標菌的抑制作用

3 總結(jié)與討論

本研究運用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析并鑒定了三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油的18種化學成分，結(jié)果顯示以油酸和棕櫚酸等脂肪酸為主，并含少量烷類、烯醛類等化合物。含量超過1.0%的化學成分有9種，占全部鑒定成分的93.68%。這與陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心對三尖杉果仁中揮發(fā)油的研究結(jié)果有類似之處(另文發(fā)表)。蘇應娟等[13]曾報道健康三尖杉葉揮發(fā)油中的主要成分為萜類化合物，占被鑒定化合物的37.93%。而本研究分析發(fā)現(xiàn)，SR1-26揮發(fā)油中僅有烯醛一類萜類物質(zhì)，含量僅占總鑒定化合物的2.34%，這個比例與張秀環(huán)等[14]分析白木香內(nèi)生真菌揮發(fā)油中萜類物質(zhì)含量相近，但具體成分不同。另外，3-甲基-2-戊酮肟在內(nèi)生真菌中為首次報道。

植物是人們長期以來尋找天然活性藥物的重要來源[15]。近年來，內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物研究發(fā)展迅速，已經(jīng)分離得到生物堿、甾體、萜類、醌類、木脂素等多種類型化合物，并多具有抗菌、抗腫瘤、促進宿主植物生長、生物防治等藥理和生物活性[16-18]。植物揮發(fā)油中存在具有藥理或生物活性的化合物，但目前對藥用植物內(nèi)生真菌揮發(fā)油成分的研究少有報道。蔣繼宏等[19]對一株產(chǎn)香銀杏內(nèi)生真菌揮發(fā)油成分檢測，發(fā)現(xiàn)具有一定的抑菌活性。本文對三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)油進行了初步的抗菌活性研究。實驗結(jié)果表明，揮發(fā)油樣品對供測試的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌表現(xiàn)一定的抑制作用，在樣品濃度為10.00 mg/mL時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制活性。

目前，關(guān)于脂肪酸的抑菌機制主要有以細胞膜為靶位點而起作用的膜機理，以引起細胞內(nèi)酸化從而使正常代謝受阻的酸化機理，影響電子傳遞體系機理及信號干擾機理等多個方面[20]。Kelsey[21]等研究發(fā)現(xiàn)從植物組織中提取到的棕櫚酸、肉豆蔻酸、亞油酸等多種脂肪酸可對存在于肉制品中的金黃色葡萄球菌顯示出較高的抑制作用;有研究證明月桂酸蔗糖酯對蠟樣芽孢桿菌具有強烈抑制活性，其中最低抑制濃度為9.375 mg/mL[22]。有關(guān)本研究的抑菌有效成分、最低拮抗?jié)舛燃耙志鷻C理有待進一步研究。

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