細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義

王 斌 夏 博 趙光忠 侯利濤 李增軍

1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院普外科，山東臨朐 262600；2.山東省腫瘤醫(yī)院外四科，山東濟(jì)南 250117

結(jié)腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，僅2000年全球即有945 000例新發(fā)病例，僅次于肺癌、乳腺癌，居惡性腫瘤發(fā)病率的第3位[1]。結(jié)腸癌病因不明，預(yù)后較差，5年存活率不超過40%。目前結(jié)腸癌的病因尚不清楚，早期診斷成為改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[2－3]。在結(jié)腸癌的生物學(xué)行為中，侵襲和轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌患者療效和預(yù)后的重要因素。尋找有關(guān)控制侵襲、防止浸潤的因素是目前結(jié)腸癌防治研究的重要課題之一。因此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，研究細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）在結(jié)腸癌與癌旁組織中的表達(dá)情況，分析ERK蛋白與結(jié)腸癌病理因素的關(guān)系，探討ERK在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集山東省臨朐縣人民醫(yī)院2008年1月～2010年12月經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的結(jié)腸癌79例患者的結(jié)腸癌組織及癌旁組織標(biāo)本，所有患者的年齡、性別、腫瘤部位、組織學(xué)類型、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、Dukes分期等病理資料完整、可查。在79例結(jié)腸癌患者中，男41例，女38例；＜60歲者40例，≥60歲者39例；結(jié)腸癌位于右半結(jié)腸35例，位于左半結(jié)腸49例；腫瘤直徑＜5 cm者36例，≥5 cm者43例；Dukes A期14例，B期31例，C期22例，D期12例；高中分化腺癌58例，低分化腺癌21例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；浸潤深度：未穿透肌層者13例，浸潤至漿膜或漿膜外者66例；癌胚抗原（CEA）水平＜5 μg/L 者 22 例，≥5 μg/L 者 57 例。 另選擇同期行結(jié)腸切除的79例非腫瘤患者組織標(biāo)本作為正常組織對(duì)照，其中，潰瘍性結(jié)腸炎39例，腸結(jié)核11例，外傷29例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 ERK-2蛋白表達(dá)檢測(cè)方法

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶（streptavidin－peroxidase，SP）法檢測(cè) ERK－2 蛋白表達(dá)情況。對(duì)石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水處理，放置于3%過氧化氫（H2O2）溶液中，室溫孵育約 30 min，給予磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5 min×2遍，滴加正常山羊血清封片40 min，而后滴加1∶30稀釋的ERK－2抗體，置于4℃條件下孵育過夜；第2天取出切片，PBS沖洗，依次滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠二抗及鏈霉卵白素，37℃條件孵育30 min；采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，復(fù)染采用蘇木精，乙醇脫水、二甲苯透明化，最后采用中性樹膠封片保存。采用HPLAS－1000彩色病理圖像免疫組化測(cè)量系統(tǒng)7.0版對(duì)圖像進(jìn)行分析，判斷ERK－2表達(dá)情況。

1.3 結(jié)果判定

ERK－2蛋白免疫組化陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色顆粒。每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞總數(shù)計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。按著色強(qiáng)度不同分別給予計(jì)分：無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分分別為：＜10%為0分，10%～50%為1分，＞50%為2 分。 兩項(xiàng)合計(jì)乘積 0 分為陰性（－），1～2 分為弱陽性（+），4分為強(qiáng)陽性（++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)；生存率分析采用Log－rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常結(jié)腸組織、癌旁組織和結(jié)腸癌組織中ERK-2蛋白陽性表達(dá)率比較

結(jié)腸癌組織中ERK－2蛋白陽性表達(dá)率[75.9%（60/79）]高于癌旁組織[51.9%（41/79）]及正常組織[13.9%（11/79）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05或 P ＜ 0.01）。見表1、圖1、2。

表1 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-2蛋白在結(jié)腸癌組織、癌旁組織及正常組織中陽性表達(dá)分布[n（%）]

2.2 ERK-2蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

ERK－2蛋白陽性表達(dá)率在不同年齡（＜60歲、≥60歲）[77.5%（31/40）、74.4%（29/39）]、性別（男/女）[70.7%（29/41）、68.4%（26/38）]、Dukes分期（A、B、C、D 期）[73.3%（11/15）、76.7%（23/30）、71.4%（10/14）、70.0%（14/20）]、CEA 水 平（＜5 μg/L、≥5 μg/L）[68.2%（15/22）、64.9%（37/57）]患者間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ERK－2蛋白陽性表達(dá)率在不同分化程度（高中分化/低分化）[82.8%（48/58）、57.1%（12/21）]、 浸潤深度（未穿透肌層/漿膜或漿膜外）[46.2%（6/13）、72.7%（48/66）]和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陽性/陰性）[76.5%（26/34）、53.3%（24/45）]患者間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-2蛋白陽性表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-2蛋白陽性表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

ERK－2蛋白陽性表達(dá)患者12個(gè)月生存率為58.2%，ERK－2蛋白陰性表達(dá)患者12個(gè)月生存率為60.4%，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ERK－2蛋白陽性表達(dá)患者24個(gè)月生存率為38.7%，低于ERK－2蛋白陰性表達(dá)患者24個(gè)月生存率（58.6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

通常來講，歐美發(fā)達(dá)國家結(jié)腸癌的發(fā)病率較高，我國發(fā)病率目前雖仍低于發(fā)達(dá)國家，但隨著我國現(xiàn)代化程度和居民生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，結(jié)腸癌發(fā)病率亦隨之增加[4]。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是在多種因素參與并作用下，經(jīng)過多階段演進(jìn)最終形成的復(fù)雜生物學(xué)現(xiàn)象。惡性腫瘤細(xì)胞最明顯的特征就是增殖的失控性，而與生長、分化有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)或障礙則是增殖失控的關(guān)鍵因素。其中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)是已發(fā)現(xiàn)并明確細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的胞外信號(hào)已經(jīng)明確了4條通路：ERK通路、JNK通路、p38通路和ERK－5通路。已證實(shí)這些通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶在生長因子類蛋白信號(hào)刺激引起的細(xì)胞反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信號(hào)蛋白包括：酪氨酸激酶受體和配體蛋白→Ras→Raf→MEK→ERK－1/ERK－2→轉(zhuǎn)錄因子→細(xì)胞增殖、分化等相關(guān)基因表達(dá)。這條途徑參與了包括細(xì)胞增殖、分化、分泌及運(yùn)動(dòng)等多種生命活動(dòng)形式的調(diào)節(jié)[5]，且在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[6]。MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在生長因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、分化過程中發(fā)揮著重要作用，ERK通路的上、下游調(diào)節(jié)元件，如位于上游的 c－src、Ras、Raf、v－mos，下游的 c－jun、c－fos、c－myc、c－myb 等均被證明是病毒癌基因，這就提示ERK通路具有惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的功能。Kawada等[7]研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平在ERK－2激活后可顯著提高，通過調(diào)節(jié)結(jié)腸癌組織中微血管的生成促進(jìn)結(jié)腸癌組織的生成和發(fā)展。Karna等[8]發(fā)現(xiàn)ERK傳導(dǎo)通路過度激活可增加成纖維細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后在裸鼠體內(nèi)的成瘤及轉(zhuǎn)移性。Massa等[9]發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞中尿激酶的蛋白水解活性可被ERK激活并誘導(dǎo)。Miyata等[10]發(fā)現(xiàn)cos細(xì)胞和FG細(xì)胞（一種來源于胰腺癌的細(xì)胞系）穿過基底膜發(fā)生遷移的過程與ERK激活有關(guān)。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞 MDA－MB－231 中 ERK－2 的活性被MEK的抑制劑PD098059抑制后，其細(xì)胞中尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑（u－PA）的表達(dá)受到抑制。Guo等[12]則發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)ERK－2的活性增高的同時(shí)，表皮生長因子（EGF）刺激MCF－7細(xì)胞具有侵襲性。這些結(jié)果均提示ERK－2可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等活動(dòng)密切相關(guān)。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中ERK－2蛋白陽性表達(dá)率[75.9%（60/79）]高于癌旁組織[51.9%（41/79）]及正常組織[13.9%（11/79）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05或P＜0.01），提示ERK與結(jié)腸癌的發(fā)生、演進(jìn)有關(guān)。ERK－2蛋白陽性表達(dá)率在不同年齡（＜60歲、≥60歲）[77.5%（31/40）、74.4%（29/39）]、性 別（男/女）[70.7%（29/41）、68.4%（26/38）]、Dukes 分期（A、B、C、D 期）[73.3%（11/15）、76.7%（23/30）、71.4%（10/14）、70.0%（14/20）]、CEA 水平（＜5 μg/L、≥5 μg/L）[68.2%（15/22）、64.9%（37/57）]因素間進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ERK－2蛋白陽性表達(dá)率在不同分化程度（高中分化/低分化）[82.8%（48/58）、57.1%（12/21）]、浸潤深度（未穿透肌層/漿膜或漿膜外）[46.2%（6/13）、72.7%（48/66）]和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陽性/陰性）[76.5%（26/34）、53.3%（24/45）]因素間進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

ERK－2蛋白陽性表達(dá)還與患者預(yù)后有關(guān)[13]。本研究中，ERK－2蛋白陽性表達(dá)組患者12個(gè)月生存率為58.2%，ERK－2蛋白陰性表達(dá)組患者12個(gè)月生存率為60.4%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ERK－2蛋白陽性表達(dá)組患者24個(gè)月生存率為38.7%，低于ERK－2蛋白陰性表達(dá)組患者24個(gè)月生存率（58.6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

本課題通過研究ERK－2蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理及預(yù)后關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ERK－2在結(jié)腸癌的診斷、治療及預(yù)后判斷中具有重要的臨床意義，在蛋白分子水平上分析研究結(jié)腸癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)因素[14－16]，掌握其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移規(guī)律，對(duì)改善結(jié)腸癌的預(yù)后提供了基礎(chǔ)。

[1]Parikh N，Shuck RL，Nguyen TA，et al.Mouse tissues that undergo neoplastic progression after K－Ras activation are distinguished by nuclear translocation of phospho－Erk1/2 and robust tumor suppressor responses[J].Mol Cancer Res，2012，10（6）：845－55.

[2]Kilanczyk，Wasik U，F(xiàn)ilipek A.CacyBP/SIP phosphatase activity in neuroblastoma NB2a and colon cancer HCT116 cells[J].Biochem Cell Biol，2012，90（4）：558－564.

[3]Liu J，Shen M，Yue Z，et al.Triptolide inhibits colon－rectal cancer cells proliferation by induction of G1 phase arrest through upregulation of p21[J].Phytomedicine，2012，19（8－9）：756－762.

[4]趙燁宏.結(jié)腸癌患者手術(shù)治療的療效分析 [J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（34）：437－438.

[5]Amsterdam A，Shezen E，Raanan C，et al.Two initiation sites of early detection of colon cancer，revealed by localization of pERK1/2 in the nuclei or in aggregates at the perinuclear region of tumor cells[J].Int J Oncol，2012，40（3）：782－788.

[6]Silva M，Jaggers GK，Verstraeten SV，et al.Large procyanidins prevent bile－acid－induced oxidant production and membrane－initiated ERK1/2，p38，and Akt activation in Caco－2 cells[J].Free Radic Biol Med，2012，52（1）：151－159.

[7]KawadaM，SenoH，KandaK，etal.Chitinase3－like1promotesmacrophage recruitment and angiogenesis in colorectal cancer[J].Oncogene，2012，31（26）：3111－3123.

[8]Karna E，Szoka L，Palka J.Thrombin－dependent modulation of β1－integrin－mediated signaling up－regulates prolidase and HIF－1α through p－FAK in colorectal cancer cells[J].Mol Cell Biochem，2012，361（1－2）：235－241.

[9]Massa F，Tormo A，Béraud－Dufour S，et al.Neurotensin－induced Erk1/2 phosphorylation and growth of human colonic cancer cells are independent from growth factors receptors activation[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，414（1）：118－122.

[10]Miyata M，Kambe M，Tajima O，et al.Membrane sialidase NEU3 is highly expressed in human melanoma cells promoting cell growth with minimal changes in the composition of gangliosides[J].Cancer Sci，2011，102（12）：2139－2149.

[11]Wang J，Wu J，Hong J，et al.PKC promotes the migration of colon cancer cells by regulating the internalization and recycling of integrin αvβ6[J].Cancer Lett，2011，311（1）：38－47.

[12]Guo D，Zhou H，Wu Y，et al.Involvement of ERK1/2/NF－κB signal transduction pathway in TF/FVⅡa/PAR2－induced proliferation and migration of colon cancer cell SW620[J].Tumour Biol，2011，32（5）：921－930.

[13]Tong QY，Qing Y，Shu D，et al.Deltonin，a steroidal saponin，inhibits colon cancer cell growth in vitro and tumor growth in vivo via induction of apoptosis and antiangiogenesis[J].Cell Physiol Biochem，2011，27（3－4）：233－242.

[14]Slattery ML，Lundgreen A，Herrick JS，et al.Genetic variation in the transforming growth factor－β signaling pathway and survival after diagnosis with colon and rectal cancer[J].Cancer，2011，117（18）：4175－4183.

[15]楊波，高建飛，饒智國，等.原位雜交法檢測(cè)結(jié)腸癌組織MMP－7 mRNA 的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床誤診誤治，2012，25（4）：56－58.

[16]Duhamel S，Hébert J，Gaboury L，et al.Sef downregulation by Ras causes MEK1/2 to become aberrantly nuclear localized leading to polyploidy and neoplastic transformation[J].Cancer Res，2012，72（3）：626－635.