Oct-4和Nestin在肺癌中共表達的臨床意義

林育紅 張麗麗▲ 劉彩剛

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，遼寧沈陽 110001

肺癌是最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤死亡率中位居前列。近年來，有包括手術、化療、放療等多種治療策略被廣泛應用于臨床的肺癌治療中。然而，大于40%的患者在接受了抗腫瘤的綜合治療后出現(xiàn)了腫瘤復發(fā)。腫瘤復發(fā)患者中有相當一部分出現(xiàn)了其他器官的轉(zhuǎn)移灶，并且預后不佳。因此，明確腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移機制，在治療肺癌的過程中有著極為重要的意義。

近年來研究表明，腫瘤干細胞在細胞的惡變、腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移、腫瘤對放化療的抵抗中起著決定性的作用[1－2]。腫瘤干細胞有著自我更新和向其他多種類型腫瘤細胞分化的能力，并且有很高的致瘤性[3]。但是，至今尚不清楚干細胞相關的基因是否也在肺癌組織中表達，及這些基因是如何調(diào)控肺癌的發(fā)生和發(fā)展的。

Oct－4是一種轉(zhuǎn)錄蛋白，通常在干細胞中表達，是未分化的胚胎干細胞自我更新中的決定性調(diào)控因子[4－5]。筆者之前的研究表明，Nestin在肺癌中顯著表達。最近，筆者又發(fā)現(xiàn)在肺癌干細胞中Oct－4和Nestin的表達明顯高于其在其他腫瘤細胞中的表達水平。但是，對于Oct－4和Nestin的表達與肺癌臨床特征之間的關系，以及Oct－4和Nestin在體內(nèi)、體外實驗中對肺癌干細胞成瘤性的作用機制，幾乎是完全不明了的。

本實驗在分析Oct－4和Nestin在肺癌干細胞成瘤作用中的角色基礎上，檢測干細胞相關基因的表達水平。而后，又檢測了320例肺癌干細胞中Oct－4和Nestin的表達水平，并分析Oct－4和Nestin的表達與預后之間聯(lián)系的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2003年1月～2006年12月于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院被確診為肺癌的患者320例，其中，年齡小于35歲者48例，54例為T1期，而有128例未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。將獲得的腫瘤組織樣本以免疫組織化學方法進行檢測。在此基礎之上，用PCR法分析其基因表達水平。入選標準：①經(jīng)過手術治療的患者；②切除腫塊病理證實確為肺癌；③取出多于15個淋巴結(jié)送檢病理；④病例資料完整。排除接受過輔助療法的患者。

1.2 實驗方法

1.2.1 集落形成實驗 肺癌干細胞及非干細胞購自沈陽華鑫生物科技有限公司，其中，肺癌干細胞組作為實驗組，而非干細胞組作為對照組。將細胞以2×104/mL密度培養(yǎng)于含有超短半橋粒（Corning，Acton，USA）的全 Mammo Cult培養(yǎng)基（STEM CELL Technologies，Vancouver，Canada）中 7 d。以盲法計數(shù)＜20 μm的細胞球數(shù)量。

1.2.2 PCR法使用TRIzol試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA）從腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞中提取全RNA，根據(jù)廠家使用說明以RNA裂解小量洗脫凈化工具（Qiagen，Chatsworth，USA）提純。每次PCR分析的單個基因的循環(huán)閾值（Ct）都按照GADPH管家基因的平均Ct進行標準化。不同細胞組間基因的表達差異由循環(huán)閾值的差值（ΔCt）決定。實驗組和對照組中每個基因表達的折疊變化由2－ΔΔCt計算所得。差值＞2的單個基因被認為是存在表達差異的。

1.2.3 免疫組織化學法 用免疫組織化學法檢測肺組織中Oct－4和Nestin的表達水平。固定320例肺癌組織，并制成4 μm的組織切片，以二甲苯脫蠟，梯度酒精逐漸水化，再以磷酸緩沖液（PBS）沖洗，分別用1∶100濃度的鼠抗人Oct－4抗體和兔抗人Nestin抗體37°C孵育 1 h，PBS液洗滌后，以最佳生物素化的二抗（Multilink Swine anti－goat/mouse/rabbit immunoglobulin，Dako，Carpinteria，USA）在 37 °C中孵育30 min。用HRP抗生物素蛋白生物素復合物在室溫下 30～60 min（以 1∶1000 的濃度，Vector Laboratories，Burlingame，USA）檢測結(jié)合生物素基化的抗體。組織片段的免疫印跡以DAB做顯色處理，以吉爾蘇木素復染并觀察。來自于個體組織的3個片段全部以單抗體著色，依照盲法，每個片段隨機選擇10個結(jié)構域通過病理檢測Oct－4和Nestin的表達。根據(jù)以下標準半定量檢測Oct－4和Nestin的表達水平，0：代表＜1%的贅生細胞印跡陽性；1+：代表≥1%而＜10%的形態(tài)學上明確的贅生細胞印跡陽性；2+：代表≥10%的形態(tài)學上明確的贅生細胞印跡陽性。顯色1+或者2+的單個樣本認為該蛋白表達陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，大量的連續(xù)數(shù)據(jù)以t檢驗分析；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或精確概率分析；疾病特異性生存率以生存分析和時間等級檢驗分析；個體因素的影響情況以COX比例機遇模型以向前階梯式選擇的方式進行多元統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞培養(yǎng)情況

取腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞在體外培養(yǎng)7 d，檢測細胞的成球情況。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞能夠形成20～100 μm的細胞球，并且可以在體外試驗中繼續(xù)傳代（圖1A－B），而非腫瘤干細胞則不能（圖1C－D）。

2.2 肺癌中Oct-4和Nestin的表達

在肺癌干細胞和非肺癌干細胞之間，用PCR法檢測干細胞相關基因表達的差異性。本研究發(fā)現(xiàn)，CD44、Oct－4、Nestin、APC、CDC2、HGF和 TGF基因在肺癌干細胞和非肺癌干細胞中均有顯著的表達差異，其中，Oct－4和Nestin通常由干細胞表達。為了顯示Oct－4和Nestin的表達特征，本研究采用320例肺癌樣本以免疫組化法分析Oct－4和Nestin的表達水平（表1）。研究發(fā)現(xiàn)，128例（40.00%）的肺癌組織中抗Oct－4陽性，而62例（19.38%）的肺癌組織中抗Nestin陽性。值得注意的是，有42例（13.13%）癌癥組織中抗 Oct－4 和抗 Nestin 同時陽性（圖2）。 分析顯示，Oct－4和Nestin的共表達與年齡、組織學類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關（P ＜ 0.05）。多元統(tǒng)計分析提示，在肺癌人群中，Oct－4和Nestin的共表達與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移獨立相關（P＜0.05）。 見表2。

表1 患者一般臨床資料（例）

2.3 Oct-4和Nestin的共表達與肺癌預后不良相關

在所有320例樣本中，303例患者生存期超過7.5年，占94.67%。生存分析顯示，有Oct－4陽性表達的肺癌患者比Oct－4陰性表達患者有較低的生存率（71.09%比91.67%，χ2=29.04，P=0.001，圖3A）。相似的是，有 Nestin 陽性表達的肺癌患者也比Nestin陰性表達的患者有較低的生存率（64.52%比 87.98%，χ2=30.71，P=0.001，圖3B）。此外，Oct－4和Nestin共表達與預后不良有著明顯的相關性（57.14%比 87.41%，χ2=48.49，P=0.001，圖3 C、表3）。 值得注意的是，15例中有13例年齡＜35歲的Oct－4和Nestin表達陽性患者在術后5年內(nèi)死亡。

表2 Oct-4和Nestin共表達的多元統(tǒng)計分析

表3 肺癌預后因子的多因素回歸分析

3 討論

研究已經(jīng)證明，從實體瘤中分離得到的腫瘤干細胞有著高度的自我更新和分化成不同表現(xiàn)型的腫瘤細胞的能力。研究中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤干細胞中有Oct－4和Nestin表達。此外，腫瘤干細胞，尤其是有Oct－4和Nestin高水平表達的腫瘤干細胞有成球能力，但是非腫瘤干細胞在同樣的細胞培養(yǎng)條件下沒有成球能力。這些異常的數(shù)據(jù)明確提示，腫瘤干細胞有著干細胞的生物學特性，并且在肺癌的發(fā)展中起著決定性的作用[6－7]。

很多基因在腫瘤干細胞中高度表達，并在維持腫瘤干細胞生物功能方面起著重要作用，例如Oct－4、Nestin、HGF、APC、CD44等。本研究以PCR方法總結(jié)了干細胞相關基因的差異表達水平，發(fā)現(xiàn)包括CD44、Oct－4、Nestin、APC、CDC2、HGF和TGF等基因在內(nèi)的很多基因都在腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞中差異表達，而Oct－4和Nestin在很多腫瘤干細胞中呈共表達。Oct－4是一種重要的能夠調(diào)節(jié)干細胞的自我更新能力和多潛能性的轉(zhuǎn)錄因子，盡管Oct－4被發(fā)現(xiàn)在一些成體的已分化細胞中表達[8]，但是它仍被認為是成體干細胞的一種生物學標記。Nestin是一種中間絲蛋白，它表達于神經(jīng)元和正在成長的細胞中。Nestin還在濾泡干細胞中表達，并且起著調(diào)節(jié)細胞重塑、增生和分化、增殖的功能[9]。

筆者近來的研究提示，Nestin也許會是一個新的可能的肺癌腫瘤標志物。本文深入的研究了320例肺癌樣本中Oct－4和 Nestin的表達情況，發(fā)現(xiàn)在其中42例樣本中Oct－4和Nestin共表達。尤為驚人的是，通用多元分析顯示，Oct－4和Nestin的共表達與起病年齡較小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關。COX回歸分析提示，Oct－4和Nestin的共表達與肺癌預后不良亦有相關性。

綜上所述，本研究顯示，Oct－4和Nestin在肺癌干細胞中顯著表達，并且其表達與腫瘤的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和肺癌患者較短的生存期相關。提示Oct－4和Nestin也許在調(diào)節(jié)肺癌發(fā)展過程中起到了重要的作用。

[1]Fabrizi E，Di Martino S，Pelacchi F，et al.Therapeutic implications of colon cancer stem cells[J].World J Gastroenterol，2010，16：3871－3877.

[2]Ginestier C，Charafe－Jauffret E，Birnbaum D.Targeting breast cancer stem cells： fishing season open[J].Breast Cancer Res，2010，12：312.

[3]Liu R，Wang X，Chen GY，et al.The prognostic role of a gene signature from tumorigenic breast－cancer cells [J].N Engl J Med，2007，356：217－226.

[4]Monsef N，Soller M，Isaksson M，et al.The expression of pluripotency marker Oct 3/4 in prostate cancer and benign prostate hyperplasia[J].Prostate，2009，69：909－916.

[5]Park D，Xiang AP，Mao FF，et al.Nestin is required for the proper selfrenewal of neural stem cells[J].Stem Cells，2010，28：2162－2171.

[6]Grimshaw MJ，Cooper L，Papazisis K，et al.Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells[J].Breast Cancer Res，2008，10：R52.

[7]Guo J，Zhou J，Ying X，et al.Effects of stealth liposomal daunorubicin plus tamoxifen on the breast cancer and cancer stem cells [J].J Pharm Pharm Sci，2010，13：136－151.

[8]Cai J，Xie D，F(xiàn)an Z，et al.Modeling co－expression across species for complex traits：insights to the difference of human and mouse embryonic stem cells[J].PLoS Comput Biol，2010，6：e1000707.

[9]Li H，Cherukuri P，Li N，et al.Nestin is expressed in the basal/myoepithelial layer of the mammary gland and is a selective marker of basal epithelial breast tumors[J].Cancer Res，2007，67：501－510.