腺苷預(yù)處理對OGD星形膠質(zhì)細(xì)胞NGF和BDNF的影響

馬世江 李 靜 靳 玫 李素芳 譚 軍

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄉(xiāng) 453003

近年來研究表明［1］，抑制缺血再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，IRI）成為目前治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）［2］和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對腦缺血具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［3］。

本研究選用SD大鼠，采用 McCarthy及謝裕華［4］的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法并在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件上稍作改進(jìn)進(jìn)行體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)純化、傳代至第三代或第四代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，在氧糖剝奪（oxygen－glucose deprivation，OGD）處理前實(shí)驗(yàn)組給予100μmol／L的腺苷預(yù)處理，研究其對內(nèi)源性NGF、BDNF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物出生24h內(nèi)的SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量10～12g。

1.2實(shí)驗(yàn)方法將SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離、消化、培養(yǎng)、鑒定，通過分組處理，隨機(jī)分為3組：正常對照組（normal control group）、氧糖剝奪組（OGD group）、腺苷預(yù)處理組（ADO group），每組各3只。正常對照組不進(jìn)行氧糖剝奪，在氧糖剝奪期及復(fù)氧糖期均更換完全DMEM培養(yǎng)基。OGD組在氧糖剝奪期更換成無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基；ADO組在氧糖剝奪前24h給予含100μmol／L腺苷的完全DMEM培養(yǎng)基，氧糖剝奪時(shí)更換為無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基。觀察氧糖剝奪8h復(fù)氧糖24h后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中NGF和BDNF的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析所有數(shù)據(jù)采用Prism4.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較均采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌NGF的變化NGF試劑盒檢測行單因素方差分析見表1。由表1可知，OGD組培養(yǎng)液中NGF活性明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明受到缺氧缺糖損傷后，可刺激NGF表達(dá)增加；ADO組與OGD組相比NGF分泌明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明腺苷預(yù)處理可以增加NGF表達(dá)。

表1 3組ELISA檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖24h細(xì)胞NGF含量比較 （s，ng／mL）

表1 3組ELISA檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖24h細(xì)胞NGF含量比較 （s，ng／mL）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與OGD組比較，★P＜0.05

3 0.043±0.007 OGD模型組 3 0.058±0.006▲ADO預(yù)處理組 3 0.076±0.004正常對照組★▲

2.2 OGD星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌BDNF的變化通過BDNF試劑盒檢測行單因素方差分析見表2。由表2可知，OGD組培養(yǎng)液中BDNF活性明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明細(xì)胞受到缺氧缺糖損傷后，可刺激BDNF表達(dá)增加；ADO組與OGD組相比BDNF分泌明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明腺苷預(yù)處理可以增加BDNF的表達(dá)。

表2 ELISA檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖24h細(xì)胞BDNF含量比較 （s，ng／mL）

表2 ELISA檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖24h細(xì)胞BDNF含量比較 （s，ng／mL）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與OGD組比較，★P＜0.01

3 1.756±0.038 OGD模型組 3 1.960±0.050▲ADO預(yù)處理組 3 2.186±0.074正常對照組★▲

3 討論

改善缺血周圍區(qū)血流供應(yīng)是近幾年國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)問題。大量研究表明，在體內(nèi)具有神經(jīng)營養(yǎng)的多種生長因子中，BDNF和NGF是近年來在神經(jīng)再生、損傷修復(fù)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。BDNF對受損神經(jīng)系統(tǒng)的再生具有積極促進(jìn)作用［5］。腦缺血發(fā)生以后，腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度與NGF和BDNF的表達(dá)水平密切相關(guān)［6］。二者的表達(dá)升高有利于缺血后腦組織損傷的修復(fù)［7］，可以明顯促進(jìn)缺血后腦神經(jīng)元的存活和生長發(fā)育，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，并能夠防止受損死亡，促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化成熟，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中具有非常重要的作用。

NGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，BDNF可改變神經(jīng)元的活性，機(jī)制可能是改變了膽堿能神經(jīng)元的功能，進(jìn)而對皮質(zhì)的可塑性進(jìn)行調(diào)節(jié)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時(shí)，特定的神經(jīng)元、局部的星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞可以迅速表達(dá)NGF及受體。缺乏NGF及BDNF軸突就不生長，而應(yīng)用NGF及BDNF能使成熟的受損神經(jīng)元軸突生長，提示NGF及BDNF可以促使軸突克服周圍環(huán)境中阻止因素而進(jìn)行生長。張燕平研究表明，NGF可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對腦梗死大鼠具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［5］。

NGF作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，是神經(jīng)系統(tǒng)維持正常發(fā)育和功能的必要因素［8］。NGF是一種亞基蛋白組成的靶組織源性細(xì)胞因子，營養(yǎng)譜比較廣泛，包括基底節(jié)膽堿能神經(jīng)元、海馬和皮層的神經(jīng)元。NGF對缺血再灌注損傷腦組織有確切的保護(hù)和治療作用，機(jī)制可能包括：（1）NGF能增強(qiáng)自由基清除劑的活性，對降低神經(jīng)元損傷有重要作用；（2）抵抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性；（3）干擾鈣通道與鈣離子排出系統(tǒng)的表達(dá)與活化，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；（4）抑制神經(jīng)元的凋亡；（5）NGF能在神經(jīng)元損傷后的促存活作用過程中，促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的恢復(fù)。NGF對早期神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育分化的影響主要表現(xiàn)在：（1）促使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化；（2）促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不僅是神經(jīng)系統(tǒng)整體發(fā)育的一個(gè)組成部分，且為神經(jīng)元發(fā)育提供不可缺少的環(huán)境條件。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)作用的主要成員之一，可對抗缺血、缺氧等病理損害保護(hù)神經(jīng)元，對發(fā)育中的運(yùn)動、感覺、交感神經(jīng)元的存活、分化和增殖及防止運(yùn)動神經(jīng)元的退行性變有促進(jìn)作用。還具有抗凋亡作用，主要機(jī)制為［9］：（1）下調(diào)NMDA受體功能，抑制谷氨酸的毒性；（2）通過誘導(dǎo)鈣結(jié)合蛋白表達(dá)，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度；（3）BDNF可以調(diào)節(jié)自由基代謝，從而保護(hù)神經(jīng)元免受自由基的攻擊；（4）BDNF可以對抗NO供體的細(xì)胞毒性，從而保護(hù)神經(jīng)元免受損傷。由此可見，腦缺血損傷后，BDNF的表達(dá)上升是通過上述適應(yīng)機(jī)體的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制減少缺血性神經(jīng)元死亡，降低腦缺血損傷后神經(jīng)功能的損傷程度［10］。

綜上所述，NGF和BDNF既有神經(jīng)營養(yǎng)，又有神經(jīng)保護(hù)作用，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究通過星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、氧糖剝奪、腺苷預(yù)處理已經(jīng)證實(shí)：腺苷預(yù)處理后，星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷減輕，腺苷預(yù)處理組較氧糖剝奪組NGF和BDNF表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腺苷預(yù)處理能夠減輕大腦損傷產(chǎn)生腦保護(hù)作用，可能與上調(diào)NGF和BDNF表達(dá)有關(guān)。局灶性腦缺血后NGF和BDNF表達(dá)增高是機(jī)體自身的代償反應(yīng)，腺苷預(yù)處理后局灶性腦缺血時(shí)NGF和BDNF表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，對機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的保護(hù)作用，我們推斷NGF和BDNF的表達(dá)上調(diào)可能是腺苷預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受形成的重要分子機(jī)制之一，為腺苷在腦缺血的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為臨床治療提供新的途徑。

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