超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞組織中黏桿菌素殘留

林 巍，李繼昌，李 健

（1．齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006；2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；3．澳大利亞蒙納什大學(xué)藥學(xué)院FADDI實驗室，墨爾本 維多利亞3052）

黏桿菌素（Colistin）是由多黏芽孢桿菌培養(yǎng)液中獲得的堿性多肽類抗生素，主要成分為黏桿菌素A（ColistinA）和黏桿菌素B（ColistinB），對革蘭陰性桿菌有強烈的抑菌作用，臨床常用其硫酸鹽。獸醫(yī)臨床中硫酸黏桿菌素常用于畜禽大腸桿菌性下痢和其他腸道細(xì)菌感染的治療。黏桿菌素還作為飼料添加劑，廣泛用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中［1］。由于其神經(jīng)毒性和腎毒性，我國規(guī)定黏桿菌素在牛、羊、豬、雞、兔的肌肉、肝的最高殘留限量為150μg／kg，在腎的殘留量為200μg／kg。國外報道黏桿菌素的檢測方法主要有微生物法、薄層色譜法、免疫學(xué)法毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法以及液相串聯(lián)質(zhì)譜法［2－6］。國內(nèi)報道的主要是微生物檢測方法和液相色譜法［7］，其中微生物檢測方法靈敏度低，而高效液相色譜熒光檢測法通常衍生過程復(fù)雜，黏桿菌素保留時間也較長，不適合大批樣本操作，液相串聯(lián)質(zhì)譜法報道較少。本試驗旨在建立一種靈敏、可靠的檢查雞組織中黏桿菌素藥物殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，保障動物源性食品的安全和維護(hù)人們的健康，為今后對黏桿菌素在雞組織中的殘留監(jiān)控提供技術(shù)手段。

1 材料和方法

1．1 儀器和設(shè)備 XevoTMTQ－S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：美國 Waters公司；Waters Masslynx質(zhì)譜工作站軟件；T25digital組織勻漿機(jī)：IKA公司；RV10 digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA公司；CL－043低溫冷凍離心機(jī)、N－EVAP氮吹儀：Thermo Fisher公司；美國Organomation；XP205電子天平：Mettler Toledo公司；固相萃取裝置：Supelco公司；C18小柱（規(guī)格500 mg／3cc）：Waters公司。

1．2 藥品與試劑 硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；乙腈、色譜純：Thermo Fisher公司；甲醇、甲酸、正己烷、鹽酸、分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Milli2Qsynthesis系統(tǒng)制備的高純水。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)品1．2mg倒入10mL的容量瓶中，用超純水溶解稀釋到100μg／mL的黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃冷藏保存。使用時，逐級稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)濃度；提取液：V（乙腈）∶V（1moL／L鹽酸水溶液）＝1∶1；洗脫液：V（甲酸）∶V（甲醇）＝3∶7。

1．3 樣品的處理

1．3．1 樣品提取 稱取2．0g雞組織（肝臟、腎臟、腦和肌肉）樣品于50mL離心管中，加入10mL提取液，高速勻漿后4 000r／min（4℃）離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移到梨形瓶中，在離心管中加入10mL提取液重復(fù)提取1次，合并上清液。

1．3．2 樣品凈化 將梨形瓶中的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙腈。加入正己烷10mL混勻后4 000r／min（4℃）離心10min。將下層水相轉(zhuǎn)移到離心管中。C18小柱依次用甲醇、水各5mL活化，取離心管中全部樣品過柱，依次用20mL／L乙腈水溶液、水2 mL淋洗柱子，抽干，用3mL洗脫液洗脫于試管內(nèi)，充分渦旋混勻；氮吹后定容到1mL，經(jīng)0．22μm濾膜后進(jìn)行測定。

1．4 測定

1．4．1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（50mm×2．1mm），粒徑1．7μm（Waters公司）；流動相A：1mL／L甲酸乙腈溶液；流動相B：2 mL／L甲酸水溶液；梯度洗脫程序見表1；流速0．3 mL／min；柱溫30℃；進(jìn)樣量5μL。

表1 梯度洗脫程序

1．4．2 串聯(lián)質(zhì)譜條件電離模式 電噴霧離子源，正離子電離（ESI＋）；監(jiān)控模式：多反映監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓3．0kV；離子源溫度150℃；脫溶劑氣流量700L／h；錐氣孔流量50L／h；去溶劑溫度450℃；碰撞氣流量0．24L／min；碰撞室壓力3．32e－5mbar；經(jīng)過優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 黏桿菌素的母離子、子離子及質(zhì)譜參數(shù)

1．5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取2．0g雞組織（肝臟、腎臟、腦和肌肉）空白樣品于離心管中，依次加入20μL不同濃度的黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，漩渦混勻，使樣品中黏桿菌素的質(zhì)量濃度分別為1．00 μg／g、0．50μg／g、0．20μg／g、0．10μg／g、0．05μg／g、0．02μg／g、0．01μg／g。以加入20μL水的樣品作對照品。按前述方法進(jìn)行處理和測定。將黏桿菌素A和黏桿菌素B的定量離子峰面積和對濃度作線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)，每個樣品測定3次。

1．6 檢測限和定量限的確定 取空白組織樣品，分別制得0．01μg／g、0．02μg／g和0．05μg／g 3個空白組織添加濃度，每個濃度設(shè)5個平行。按上述樣品前處理方法操作，測得噪音信號的平均值，按信噪比≥3為檢測限，信噪比≥10為定量限。

1．7 添加回收率和精密度 準(zhǔn)確稱取雞組織（肝臟、腎臟、腦和肌肉）空白樣品2．0g于離心管中，加入一定體積的黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液至樣品中，使黏桿菌素在組織中的濃度為0．02μg／g、0．10μg／g、1．00 μg／g。按照本方法確定的條件進(jìn)行加標(biāo)回收重復(fù)性試驗，每批做6個重復(fù)，共做4個批次，計算回收率及日內(nèi)和日間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜－質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化 本試驗采用的流動相參考了Eric等［8］的報道，為了完善色譜峰型在其基礎(chǔ)上做了改變，調(diào)整了甲酸水溶液中甲酸的含量，將甲酸由1mL／L增加到2mL／L，同時乙腈中添加少量甲酸增加了離子化效率，流動相A和B最終分別為1mL／L甲酸乙腈和2mL／L甲酸水溶液。同時探討了流動相A的比例為90%、80%、60%和50%時的分離情況和峰形，發(fā)現(xiàn)當(dāng)A相為80%時藥物色譜峰形最佳，且需要的分析時間最短。串聯(lián)質(zhì)譜條件的選擇，分別采用正離子掃描模式和負(fù)離子掃描模式對黏桿菌素進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏桿菌素在負(fù)離子掃描模式下質(zhì)譜響應(yīng)弱，而在正離子掃描模式下則得到了明顯的分子離子峰。在正離子掃描模式下確定了藥物的最佳碰撞能（如表2），黏桿菌素A和黏桿菌素B的定量離子分別為390．82→379．08和386．03→374．35。由于藥物兩種主要成分的分子量相近，保留時間基本一致，均在1．52 min處出現(xiàn)了色譜峰，定量分析時取其峰面積之和。

2．2 樣品前處理條件的確定 根據(jù)文獻(xiàn)報道，黏桿菌素在酸性條件下穩(wěn)定，首先選用了常用的三氯乙酸作為提取試劑，同時為了去除血漿中的蛋白加入了乙腈［6］，設(shè)定了幾個不同濃度的配比，但是都沒有得到滿意的回收率。通過嘗試在乙腈中加入1moL／L鹽酸［2］進(jìn)行提取，獲得不錯的回收添加率，比較了1 moL／L鹽酸比例為0%、10%、30%、50%、70%和100%時的提取效果，結(jié)果表明，在V（乙腈）∶V（1 moL／L鹽酸）體積比1∶1的情況下獲得較好的回收率。樣品凈化［3］中，洗脫液我們嘗試了酸性洗脫、堿性洗脫和中性洗脫，最后選擇體積比V（甲酸）∶V（甲醇）為3∶7的甲醇酸性溶液，結(jié)果表明，在回收率和凈化效果方面均能獲理想的效果。

2．3 方法性能評價

2．3．1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及線性范圍 在選定的色譜條件下進(jìn)行 UPLC／MS／MS測定，在0．01μg／g～1．00μg／g范圍內(nèi)，黏桿菌素峰面積和與濃度呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＞0．997，結(jié)果見表3。

2．3．2 回收率與精密度 濃度為0．02μg／g、0．1 μg／g、1．0μg／g的黏桿菌素在雞組織（腎臟、肝臟、肌肉和腦）中添加回收率在83．43%～98．15%之間，日內(nèi)和日間變異系數(shù)（RSD）均小于10%，見表4。結(jié)果表明，采用本方法測定動物組織中的黏桿菌素具有較好的精密度和重復(fù)性。空白組織添加標(biāo)準(zhǔn)品及空白組織樣品的色譜圖見圖1。

表3 方法的線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

表4 雞組織中黏桿菌素不同濃度的回收率和變異系數(shù)

2．3．3 檢測限與定量限 采用本試驗中樣品處理方法，在所建立的色譜條件下，能將黏桿菌素與組織中其他組分較好的分離，黏桿菌素在雞組織中的定量限為20μg／g，最低檢測限為10μg／g。

3 結(jié)論

本方法靈敏度高，樣品提取簡單，在2min內(nèi)即可完成檢測過程，體現(xiàn)了定量準(zhǔn)確、操作簡便易行、分析時間短的優(yōu)點。鑒于國內(nèi)雞組織中黏桿菌素殘留限量規(guī)定為150μg／g，本試驗建立的黏桿菌素殘留檢測UPLC－MS／MS方法能夠滿足雞組織中黏桿菌素殘留檢測的要求。

［1］ Decolin D，L Eroy P，Nicolas A，etal．Hyphenated liquid chromatographic method for the determination of colistin residues in bovine tissues［J］．J Chromatogr Sci，1997，35（12）：557－564．

［2］ Li J，Milne R W，Nation R L，etal．A simple method for the assay of colistin in human plasma，using pre－column derivatization with 9－fluorenylmethyl chloroformate in solid－phase extraction cartridges and reversed－phase high－performance liquid chromatography［J］．J Chromatogr B：Biomed Sci Appl，2001，761（2）：167－175．

［3］ Li J，Milne R W，Nation R L，etal．Simple method for assaying colistin methanesulfonate in plasma and urine using highperformance liquid chromatography，Antimicrob Agents Chemother［J］．Antimicrob Agents Chemother，2002，46：3304－3307．

［4］ Li J，Milne R W，Nation R L，etal．Use of high－performance liquid chromatography to study the pharmacokinetics of colistin sulfate in rats following intravenous administration，Antimicrobial Agents Chemotherapy［J］． Antimicrobial Agents Chemotherapy，2003，47：1766－1770．

［5］ Britt J，Matti K，Otto C，etal．Quantitative analysis of colistinA and colistinB in plasma and culture medium using a simple precipitation step followed by LC／MS／MS［J］．Pharm Biomed Anal，2009，49：760－767．

［6］ Wan E C H，Ho C，Della W S，etal．Detection of residual bacitracin A，colistin A，and colistin B in milk and animal tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］．Anal Bioanal Chem，2006，385：181－188．

［7］ 丁煥中，吳潔珊，曾振靈，等．動物組織黏菌素殘留柱前衍生化高效液相色譜－熒光檢測方法的建立［J］．中國獸醫(yī)科學(xué)，2009，39（5）：461－464．

［8］ Eric C W，Clare H，Della W S，etal．Detection of residual bacitracin A，colistin A，and colistin B in milk and animal tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］．Anal Bioanal Chem，2006，385：181－188．

［9］ Ma Z，Wang J P，Gerber J P，etal．Determination of colistin in human plasma，urine and other biological samples using LCMS／ MS［J］．J Chromatogr B：A nal Technol Biomed Life Sci，2008，862：205－212．

［10］Cao G Y，Ali F E A，Chiu F，etal．Development and validation of a reversed－phase high－performance liquid chromatography assay for polymyxin B in human plasma［J］．Antimicrobial Chemotherapy，2008，343（9）：343－349．

圖1 空白樣品肝臟（a）、腦（b）、腎臟（c）、肌肉（d）的色譜圖和肝臟（A）、腦（B）、腎臟（C）和肌肉（D）的黏桿菌素添加回收的色譜圖（0．02μg／g）