華南地區(qū)致病性豬大腸桿菌的鑒定和血清型分布

王文豪，蘇丹萍，張丹琳，申翰欽，張顯浩，陳瑞愛(ài)，，賀東生，

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642；2．廣東省獸用生物制品技術(shù)研究與應(yīng)用企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 肇慶526238）

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬腸道傳染性疾病，其主要危害1月齡以?xún)?nèi)的仔豬。根據(jù)發(fā)病日齡及臨床癥狀可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫3種。該病的發(fā)病率與死亡率均很高，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)極大的危害。由于大腸桿菌的血清型眾多且各疫苗之間交叉免疫保護(hù)力低下，預(yù)防該病時(shí)一定要選擇適合當(dāng)?shù)亓餍械膬?yōu)勢(shì)菌株制備的疫苗進(jìn)行免疫接種，才能起到事半功倍的效果。為了解華南地區(qū)豬大腸桿菌病流行情況及其優(yōu)勢(shì)血清型的分布情況，以便為該病的防控提供理論依據(jù)，我們進(jìn)行了此項(xiàng)觀察，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 病料 分別來(lái)自廣東、廣西、江西、湖南、福建、海南7個(gè)地區(qū)的38家豬場(chǎng)病豬的肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)等組織。

1．2 主要試劑和培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍(lán)平板，均購(gòu)自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；藥敏紙片及生化試劑，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；47種大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O抗原單價(jià)血清，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；昆明系SPF小鼠，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)。

1．3 大腸桿菌的分離培養(yǎng) 用接種環(huán)無(wú)菌采取病料于麥康凱平板上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18～24h，挑取單個(gè)粉紅色菌落于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，取伊紅美藍(lán)上具有金屬光澤的單個(gè)菌落涂片染色鏡檢。

1．4 生化試驗(yàn) 按常規(guī)方法對(duì)分離的74株細(xì)菌進(jìn)行葡萄糖、麥芽糖、硝酸鹽、乳糖、靛基質(zhì)、M．R、蔗糖、明膠、V－P等12項(xiàng)生化指標(biāo)測(cè)定［1］，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1．5 大腸桿菌血清型鑒定 挑取經(jīng)分離培養(yǎng)、形態(tài)特點(diǎn)、生化鑒定為大腸桿菌的單菌落，接種到肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h。把菌液轉(zhuǎn)移至5mL的離心管中，5 000r／min離心10min；去上清，沉淀用4 mL生理鹽水振蕩混勻，5 000r／min離心10min；重復(fù)洗滌3次后去上清，沉淀用1．5mL生理鹽水振蕩混勻，制成濃稠菌懸液，121℃高壓2h，破壞細(xì)菌K抗原［2］。待菌懸液冷卻后，取25μL抗原與25μL稀釋的血清與潔凈的玻璃板上混勻，如1～3 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象可判定為陽(yáng)性，同時(shí)用無(wú)菌生理鹽水與血清混合作對(duì)照，觀察細(xì)菌有無(wú)自凝現(xiàn)象［3］。

1．6 小鼠致病性試驗(yàn) 從優(yōu)勢(shì)血清型中選取18株大腸桿菌分別接種普通肉湯，37℃培養(yǎng)18h。稀釋細(xì)菌到109CFU／mL后經(jīng)腹腔注射小鼠，每株菌注射4只，每只0．2mL；另4只作為陰性對(duì)照，腹腔注射0．2mL新鮮肉湯，觀察小鼠的發(fā)病死亡情況并對(duì)死亡小鼠剖檢觀察，無(wú)菌采取死亡鼠的肝臟組織接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h后對(duì)分離到的細(xì)菌重新鑒定。判斷標(biāo)準(zhǔn)：致死4只或3只小鼠的為強(qiáng)毒株；2只的為中毒株；1只的為低毒株；不致死的為無(wú)毒株［4］。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 從病料中分離到的74株細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)。在伊紅美藍(lán)平板上長(zhǎng)出有金屬光澤的紫色菌落。這些菌落經(jīng)革蘭染色后在顯微鏡下均為兩端鈍圓的革蘭陰性菌。

2．2 生化試驗(yàn) 74株分離菌經(jīng)生化試驗(yàn)結(jié)果均符合大腸桿菌的生化鑒定特征，見(jiàn)表1。

2．3 O抗原血清型鑒定 由玻板凝集試驗(yàn)可知，74株大腸桿菌分離菌中的66株分屬于14個(gè)血清型，優(yōu)勢(shì)血清型為 O107、O101、O9、O60、O26，占分離株的70．3%，另有8株未定型，占分離株的10．8%。見(jiàn)表2。

2．4 毒力試驗(yàn) 從優(yōu)勢(shì)血清型 O107、O101、O9、O60、O26中選出18株代表菌株進(jìn)行小鼠毒力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，18株菌株中有7株強(qiáng)毒株，7株中等毒力株，2株低毒株，2株無(wú)毒株。見(jiàn)表3。

表1 分離菌株的生化鑒定

表2 華南地區(qū)大腸桿菌分離株血清型鑒定

表3 優(yōu)勢(shì)血清型菌株的毒力試驗(yàn)

3 討論

本文對(duì)華南地區(qū)大豬場(chǎng)，尤其是發(fā)病豬內(nèi)臟器官（菌血癥）的致病性大腸桿菌的血清型進(jìn)行分離和鑒定。在鑒定過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有些菌株的O抗原能夠與多個(gè)單因子血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，這和黃炯［5］、陶勇［6］報(bào)道的一致。在凝集試驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，來(lái)源不同的菌株在出現(xiàn)與多個(gè)單因子血清都有凝集反應(yīng)時(shí)，每次出現(xiàn)凝集反應(yīng)的那幾個(gè)單因子血清種類(lèi)基本上是相同的。此外，需要注意的是，當(dāng)有單因子血清O101與O107、O117等血清同時(shí)與某一菌株反應(yīng)時(shí)，O101血清的凝集反應(yīng)現(xiàn)象總是最為明顯。同時(shí)在O101沒(méi)有出現(xiàn)凝集反應(yīng)，而O107與O117、O131等其他血清同時(shí)與某一菌株反應(yīng)時(shí)，O107的反應(yīng)程度通常是最大的。推測(cè)發(fā)生這種現(xiàn)象的菌株可能存在多種表面抗原，且這些表面抗原具有某種共同的特性。目前對(duì)于大腸桿菌的分型主要是通過(guò)血清型鑒定來(lái)實(shí)現(xiàn)的，能否在血清型鑒定的基礎(chǔ)上站在共性抗原這個(gè)角度對(duì)大腸桿菌進(jìn)行進(jìn)一步分類(lèi)值得考慮。

豬場(chǎng)中致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型在不同地區(qū)和不同時(shí)間會(huì)有改變。各血清型之間不但具有區(qū)域差異性，而且就算是在同一地區(qū)隨著時(shí)間的變化血清型也會(huì)隨之變化。高云英等在2005年曾報(bào)道，陜西省豬大腸桿菌流行的優(yōu)勢(shì)血清型為O139、O101、O149、O141、O60［7］。陳祥等于2008年對(duì)華東地區(qū)部分豬場(chǎng)血清型鑒定后發(fā)現(xiàn)，O149、O107、O139、O93和O91是該地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)血清型［8］。不僅如此，1998年，姜衛(wèi)東等曾報(bào)道，O119、O60、O75、O141、O20、O8和O101為廣東省豬大腸桿菌流行的優(yōu)勢(shì)血清型［9］。10余年后，2010年蘇丹萍等再次對(duì)廣東地區(qū)豬大腸桿菌分離鑒定后，發(fā)現(xiàn)血清型O138、O9為該地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)血清型［10］。而這些都與華南地區(qū)豬大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型 O107、O101、O9、O60、O26有一定的差別。在本試驗(yàn)定型的66株大腸桿菌中有14種血清型，另有8株未定型，這8株菌株是否屬于47種主要血清型之外或是新流行的其他血清型尚待進(jìn)一步研究。在華南地區(qū)各省份各豬場(chǎng)之間大腸桿菌血清型分布差異也較大，甚至同一豬場(chǎng)也有幾種血清型菌株同時(shí)存在，因此必須定期對(duì)豬場(chǎng)的大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，從而研制血清型針對(duì)性強(qiáng)的疫苗才是防控該病的關(guān)鍵。本試驗(yàn)從定型的菌株中選出5種18株優(yōu)勢(shì)血清型菌株進(jìn)行毒力試驗(yàn)，毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，在5種優(yōu)勢(shì)菌株中均可以找到較強(qiáng)毒力的菌株。本試驗(yàn)對(duì)近年來(lái)華南地區(qū)豬致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型做了系統(tǒng)調(diào)查，為以后大腸桿菌疫苗研制和疫病防控奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 陸承平．獸醫(yī)微生物學(xué)［M］．3版．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：215－223．

［2］ 閆祖書(shū)，魏揀選，張彥明，等．陜西省部分地區(qū)仔豬水腫病病原的分離鑒定［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26（7）：79－81．

［3］ 張曉東．一例雞大腸桿菌的分離與鑒定［J］．中國(guó)家禽，2011，33（17）：55．

［4］ 王紅琳，熊忠良，周紹鳳，等．湖北省仔豬致病性大腸桿菌血清型鑒定［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23（3）：68－69．

［5］ 黃炯，黃麗茜，卓菲婭，等．雞致病性埃希氏大腸桿菌不同菌株間同源性抗原的研究［J］．中國(guó)畜禽傳染病，1998，20（3）：163－164．

［6］ 陶勇．四川雞源致病性大腸桿菌血清型鑒定及質(zhì)粒DNA分析［D］．雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001．

［7］ 高云英，李浩波，李琳，等．陜西仔豬致病性大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性測(cè)定［J］．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（9）：12－15．

［8］ 陳祥，趙李祥，高崧，等．豬源大腸桿菌（ETEC、STEC、AEEC）毒力基因及其與O抗原型的關(guān)系［J］．微生物學(xué)報(bào)，2008，48（7）：857－862．

［9］ 姜衛(wèi)東，黃引賢．廣東省仔豬腹瀉大腸桿菌血清型鑒定［J］．中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18（1）：64－66．

［10］蘇丹萍，趙彥宗，陳敏鴻，等．廣東地區(qū)部分豬場(chǎng)大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］．畜牧與獸醫(yī)，2010，42（7）：80－82．