基于聚焦離子束的氮化硅納米孔的制備和表征

武靈芝， 吳宏文， 劉麗萍， 葉曉峰， 劉全俊

1.南京郵電大學(xué)地理與生物信息學(xué)院，南京 210046；

2.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，南京 210096

引 言

納米孔作為一種新型的納米探測(cè)器，是單分子檢測(cè)的一項(xiàng)重要技術(shù)，其低成本、高通量的特性成為DNA超快速測(cè)序?qū)崿F(xiàn)的關(guān)鍵技術(shù)之一[1～5]。1996年，Kasianowicz等人[6]首次報(bào)道了α-溶血素(α-HL)蛋白質(zhì)納米孔，并檢測(cè)出DNA和RNA分子過(guò)孔產(chǎn)生的阻塞電流。此方法一經(jīng)提出，就引起了廣泛的關(guān)注，也是生物膜上各種通道轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米孔的開(kāi)端。不過(guò)，由于生物納米孔脆弱、不穩(wěn)定、孔徑無(wú)法隨意控制，限制了它的廣泛應(yīng)用。隨著微加工技術(shù)的發(fā)展，固態(tài)納米孔應(yīng)運(yùn)而生。2001年，Li等人[7]首次利用自制的離子束反饋控制系統(tǒng)在Si3N4薄膜上刻蝕出納米孔，用于DNA檢測(cè)。隨后，Dekker小組[8]利用300 kV的高能聚焦電子束 (focus ion beam，F(xiàn)IB)在SiO2薄膜上刻蝕出納米孔。隨著研究的日趨升溫，更多制備固態(tài)納米孔的方法陸續(xù)出現(xiàn)，如應(yīng)用聚焦電子束誘導(dǎo)刻蝕[9～11]、低能電子束刻[12～14]、激光束光刻[15,16]、電化學(xué)腐蝕[17～19]等方法，在氮化硅、氧化硅或其它金屬氧化物等薄膜介質(zhì)上制備出穩(wěn)定的納米孔。為了得到更小的孔，通過(guò)原子沉積[17,18]、離子束沉積[8～10,19]、高能電子束液化[23～25]等進(jìn)行縮孔的技術(shù)也得到發(fā)展，以滿足納米孔的應(yīng)用[17～22]。同時(shí)，制備納米孔的材料也更加廣泛，從氧化硅等金屬氧化物，到塑料、玻璃、石墨烯等高分子化合物，都成為固態(tài)納米孔的加工材料[10～15,26～30]。固態(tài)納米孔具有穩(wěn)定性好，尺寸可控，表面特性可調(diào)等優(yōu)勢(shì)，已成為目前單分子檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

不過(guò)，固態(tài)納米孔的制備工藝目前仍然比較復(fù)雜，成功率和穩(wěn)定性有待提高，納米孔的形貌特征也直接影響著納米孔器件的靈敏度和可靠性。因此，發(fā)展一種簡(jiǎn)單、可靠的納米孔制備工藝是目前納米孔器件發(fā)展的關(guān)鍵。本文以氮化硅絕緣材料為基底，采用微加工技術(shù)設(shè)計(jì)和制備了自支撐的氮化硅懸空膜結(jié)構(gòu)，然后，利用聚焦離子束 (FIB)刻蝕懸空膜。通過(guò)優(yōu)化聚焦離子束的系統(tǒng)參數(shù)，得到一系列孔徑和錐度可控的納米孔。制備好的納米孔置于膜片鉗檢測(cè)裝置中，顯示出良好的伏安特性。當(dāng)加入DNA分子時(shí)，電流瞬時(shí)下降，得到一系列明顯、穩(wěn)定的阻塞信號(hào)。這些結(jié)果表明，本文采用的固態(tài)納米孔的制備工藝是切實(shí)可行的，該方法制備的納米孔可以用于不同生物分子的檢測(cè)和分析，促進(jìn)其在基因測(cè)序，生物傳感等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

材料和方法

材料

采用4寸晶圓、厚310μm、<100>型雙面拋光的單晶硅片為基片，先后通過(guò)低壓氣相沉積分別沉積500 nm SiO2和100 nm Si3N4薄膜。所用硫酸、過(guò)氧化氫、氫氟酸、氫氧化鉀、氟化銨、乙醇和丙酮等試劑均為分析純，所用溶液均為去離子超純水配置(Millipore，>18 MΩ/cm)。

Si3N4膜懸空結(jié)構(gòu)的制備

以4寸晶圓、厚310μm、<100>型雙面拋光單晶硅片為基底，通過(guò)濕氧化和低壓氣相沉積，分別沉積500 nm SiO2和100 nm Si3N4的薄膜，然后，腐蝕或刻蝕形成Si3N4膜懸空結(jié)構(gòu)。

掩模版圖形的設(shè)計(jì)

在腐蝕或刻蝕的過(guò)程中，利用傳統(tǒng)的光刻技術(shù)，先在基片上均勻地甩上一層抗蝕劑(也稱光刻膠)，然后，通過(guò)掩模版在各種波長(zhǎng)的光下曝光，將掩模版上的圖形轉(zhuǎn)移到光刻膠上。

各層膜的制備

將基片清洗干凈后，通過(guò)濕氧化的方法在硅片雙面生長(zhǎng)約500 nm厚的SiO2層，作為過(guò)渡層。然后，用化學(xué)氣相沉積的方法將Si3N4膜沉積在雙面SiO2膜上。

各層膜的腐蝕

為了進(jìn)一步得到Si3N4膜的懸空結(jié)構(gòu)，需要去除掉部分Si和SiO2形成的Si3N4懸空結(jié)構(gòu)。膜腐蝕加工過(guò)程如圖1所示。 (A)掩膜版圖形的轉(zhuǎn)移：在已沉積了膜的Si基片的一面，利用甩膠機(jī)均勻地甩上一層光刻膠 (正膠)，用紫外光進(jìn)行曝光，使暴露在光下的光刻膠發(fā)生分解反應(yīng)，保留未發(fā)生分解的光刻膠，從而將掩膜版上的圖形轉(zhuǎn)移到光刻膠上。(B)刻蝕Si3N4膜層以及SiO2膜層：光刻版圖形轉(zhuǎn)移到光刻膠上后，曝光部分的膠被清洗掉，相應(yīng)的Si3N4層暴露出來(lái)。用CF4/O2等離子體刻蝕Si3N4和SiO2層，最后，用發(fā)煙硝酸清洗掉剩下的光刻膠，并用氧等離子體清洗。 (C)腐蝕Si基片：以Si3N4層為保護(hù)層，用45%KOH溶液在85℃下將Si層腐蝕，直至另一面的SiO2層為止。 (D)腐蝕SiO2膜：用BHF溶液 (將HF、NH4F和去離子水按照一定比例配置而成)腐蝕SiO2層。通過(guò)以上步驟，獲得自支撐的Si3N4膜懸空結(jié)構(gòu)。

基于FIB的納米孔制備

本文采用FEI公司生產(chǎn)的聚焦離子束加工系統(tǒng)，型號(hào)為Strata FIB 201，可利用離子束刻蝕出納米級(jí)或微米級(jí)的一維或二維結(jié)構(gòu)，以及一定深度的三維結(jié)構(gòu)，或者用離子束誘導(dǎo)化學(xué)氣相沉積方法沉積納米及微米級(jí)的金屬與介電質(zhì)結(jié)構(gòu)材料。儀器所使用的軟件為FEI’sxP2.25，采用Ga69液態(tài)金屬離子源，加速電壓為5～30 kV；離子束流強(qiáng)度為1～11500 pA(分10檔)；離子束成像分辨率為7 nm(1 pA、30 kv)；樣品臺(tái)直徑為50 mm；離子束通道的真空度保持在10－4Pa，采用spot打孔模式。實(shí)驗(yàn)樣品為自制的氮化硅懸空薄膜，通過(guò)設(shè)定不同的FIB作用時(shí)間，制備不同孔徑的納米孔，然后通過(guò)掃描電鏡 (scanning electron microscope，SEM)成像系統(tǒng)對(duì)納米孔進(jìn)行表征和分析。

DNA過(guò)孔實(shí)驗(yàn)

制備好的納米孔用于λ-DNA過(guò)孔信號(hào)檢測(cè)。λ-DNA溶解在TE緩沖液中 (10 mmol/L TrisHCl、1 mmol/L EDTA、1 mol/L KCl，pH 8.0，25℃)，濃度為 100 nmol/L。將納米孔(孔口及孔底直徑為15 nm和30 nm，厚度為100 nm)置于檢測(cè)流體中。如圖2所示，裝置被氮化硅薄膜分割成兩個(gè)室，上面的為cis室，下面的為trans室，然后將兩個(gè)AgCl電極分別置于兩個(gè)室內(nèi)，電極引出來(lái)與膜片鉗 (Axon Instruments，Axopatch 700B)裝置連接。當(dāng)施加電壓后，電場(chǎng)分布在納米孔及其附近。電流信號(hào)通過(guò)16位的DAQ數(shù)字卡采集，采樣頻率為10 kHz。為了去除電磁噪音，整個(gè)流體裝置放入Faraday屏蔽箱。DNA分子加入負(fù)極的室內(nèi)后，在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下，從負(fù)極向正極運(yùn)動(dòng)，進(jìn)入納米孔的捕獲區(qū)。DNA過(guò)同一納米孔的信號(hào)經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，過(guò)孔事件通過(guò)Labview記錄并用Matlab軟件分析。

結(jié)果和討論

SEM表征納米孔

FIB是一種極具潛力的納米加工工具，可用于離子束曝光、刻蝕、輔助沉積或注入摻雜等[5～10]。本文采用FIB在氮化硅懸空薄膜上打孔，通過(guò)設(shè)定不同的打孔時(shí)間，制備得到十幾到幾百納米的孔。如圖3顯示，當(dāng)FIB作用時(shí)間為15、10、5、3和1 s時(shí)，分別得到孔徑為41.60、37.94、32.68、26.9和16.67 nm的納米孔。作用時(shí)間太短時(shí)，如0.3 s，薄膜未能被擊穿。通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)保持離子加速電壓和離子束電流不變，隨著FIB作用時(shí)間的增加，制備的納米孔的孔徑會(huì)不斷增大。但孔徑的增大和作用時(shí)間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。隨著作用時(shí)間的增加，孔徑增加的速度逐漸減小。當(dāng)時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，孔徑并不會(huì)無(wú)限地增大，而是趨于一個(gè)穩(wěn)定的值。通過(guò)對(duì)不同厚度的氮化硅薄膜打孔分析，我們發(fā)現(xiàn)這一規(guī)律同樣適用。當(dāng)離子束電壓、離子束電流、離子束通道真空度為定值時(shí)，孔徑的大小變化與作用時(shí)間有關(guān)，與薄膜的厚度無(wú)關(guān)。

通過(guò)SEM電鏡測(cè)得的錐形孔的孔口和孔底直徑，以及薄膜厚度，我們得到了納米孔的錐度角。如圖4所示，在設(shè)定的打孔條件下，隨著離子束作用時(shí)間的增長(zhǎng)，雖然孔徑在增大，但納米孔的錐度角卻越來(lái)越小，最終趨近于72°角。這和離子束的能量及入射角等因素是相關(guān)的[13,31]。聚焦離子束中鎵離子束的能量分布并不是一個(gè)嚴(yán)格的點(diǎn)，而是呈高斯分布，離子束中央部分能量較高，然后，逐漸向邊緣遞減。此外，打孔時(shí)，離子束聚焦的位置和離子束的束徑也會(huì)影響到納米孔的形貌。

納米孔的伏安特性

制備好的固態(tài)納米孔置于圖2所示的檢測(cè)裝置中，進(jìn)行電學(xué)信號(hào)檢測(cè)。當(dāng)在納米孔兩側(cè)施加一系列不同強(qiáng)度的正、負(fù)電場(chǎng)時(shí)，電解質(zhì)溶液通過(guò)納米孔作定向運(yùn)動(dòng)，得到不同的離子電流。圖5A為溫度為25℃時(shí)，不同孔徑的納米孔在1 mol/L的KCl溶液條件下得到的伏安特性曲線，可見(jiàn)孔徑增大，得到的離子電流也增大。納米孔具有一定的整流效應(yīng)，這主要是由于納米孔有限的空間使得通過(guò)的離子同孔壁表面的電荷發(fā)生相互作用，產(chǎn)生了離子優(yōu)先選擇性。當(dāng)然，離子電流的整流特性不僅與納米孔的形狀有關(guān)，而且還與溶液成分、溶液濃度和pH值等因素有關(guān)[32,33]。另外，我們對(duì)納米孔的電信號(hào)進(jìn)行了理論預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)納米孔處于電解質(zhì)溶液中時(shí)，薄膜兩側(cè)的電極所測(cè)得的響應(yīng)電流和檢測(cè)系統(tǒng)的電阻有關(guān)，主要包括溶液的電阻及納米孔本身的電阻。根據(jù)Hall對(duì)柱形納米孔的電阻理論，我們對(duì)錐形納米孔的電阻進(jìn)行了估算[34～36]。按照公式(1)，納米孔電阻主要包括孔電阻、通道電阻及接觸電阻，見(jiàn)圖5B。

這里，ρ為溶液的電阻率 (如25℃下，1 mol/L KCl，ρ為0.08953Ω·m)，a和b分別為錐形孔孔口和孔底的直徑，d1和d2分別為上、下薄膜的厚度，L為納米孔通道的長(zhǎng)度。通過(guò)對(duì)不同濃度KCl溶液下得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論值的比較，證明該公式較好地反映了錐形納米孔的電阻特性。

DNA過(guò)納米孔

目前，納米孔主要用于DNA單分子測(cè)序，因此，利用制備的納米孔，我們對(duì)λ噬菌體中的脫氧核糖核酸 (λ-DNA，48.5 kbp)進(jìn)行了檢測(cè)。λ-DNA的直徑為2.4 nm，線性條件下，長(zhǎng)達(dá)十幾微米。當(dāng)加入DNA分子到負(fù)極腔后，DNA在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下游向正極。如圖6A所示，一旦DNA分子進(jìn)入納米孔，就會(huì)由于體積阻塞效應(yīng)引起電流的瞬時(shí)下降，每一個(gè)阻塞信號(hào)代表了一個(gè)DNA分子過(guò)孔事件。從圖中可以看出，單位時(shí)間內(nèi)DNA過(guò)孔的通量比較高，可達(dá)到檢測(cè)的目的。阻塞信號(hào)主要通過(guò)阻塞電流 (current blockage)和易位時(shí)間(transition time)來(lái)表征。阻塞電流是DNA分子在納米孔中由于體積阻塞效應(yīng)引起的電流的急劇下降；易位時(shí)間是DNA分子穿過(guò)納米孔的時(shí)間，主要包括在孔口捕獲區(qū)與孔相互作用進(jìn)入納米孔及在納米孔內(nèi)運(yùn)動(dòng)的時(shí)間。通過(guò)對(duì)大量過(guò)孔事件的統(tǒng)計(jì)，得到了如圖6B和C所示的阻塞信號(hào)的分布直方圖。從圖中可以看出，阻塞電流和易位時(shí)間分別呈高斯分布和泊松分布。當(dāng)電壓為400 mV時(shí)，阻塞電流為170 pA，易位時(shí)間分布在1～10 ms。易位時(shí)間比DNA通過(guò)更小孔 (如10 nm和~200-800μs)的時(shí)間要長(zhǎng)，這可能是因?yàn)镈NA與納米孔之間的相互作用引起的。隨著驅(qū)動(dòng)電壓的增大，阻塞電流逐漸增大，同時(shí)過(guò)孔速度加快，易位時(shí)間減少。考慮到目前DNA過(guò)納米孔測(cè)序的主要問(wèn)題之一就是過(guò)孔速度過(guò)快，直接影響到過(guò)孔信號(hào)的采集。因此，我們?cè)谠龃箅妷?、提高DNA過(guò)孔的通量和阻塞電流強(qiáng)度的同時(shí)，也要考慮到DNA分子過(guò)孔的速度。

總 結(jié)

本文利用聚焦離子束在氮化硅薄膜上刻蝕納米孔，發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變打孔時(shí)間等聚焦離子束的系統(tǒng)參數(shù)，可以制備出孔徑和錐度可控的納米孔，以滿足不同生物分子檢測(cè)的需求。該方法簡(jiǎn)單、可靠，制備的成功率比較高。通過(guò)SEM和電學(xué)信號(hào)顯示，該納米孔具有很好的表面特性和伏安特性。同時(shí)，我們利用制備的納米孔對(duì)DNA分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到了較高的過(guò)孔通量和阻塞信號(hào)，進(jìn)一步證明了基于FIB的氮化硅納米孔加工工藝的可靠性。隨著固態(tài)納米孔制備工藝的不斷完善，納米孔有望發(fā)展成為一種方便、快速、廉價(jià)的單分子檢測(cè)技術(shù)，給未來(lái)生物工程及人類的個(gè)性化醫(yī)療衛(wèi)生帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。

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