線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展

陸久維， 翟宇佳， 孫 飛

中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，生物大分子國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101

引 言

早在130年前，Ringer[1]就發(fā)現(xiàn)鈣離子在心肌細(xì)胞收縮中具有重要作用，由此開(kāi)啟了研究鈣信號(hào)的時(shí)代。事實(shí)上，細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的形成和傳導(dǎo)都是受到高度調(diào)節(jié)的，存在“開(kāi)”和“關(guān)”兩種機(jī)制以精確調(diào)控鈣離子的時(shí)空分布[2]。

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的能量工廠，其提供的能量約占細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量的95%[3]。此外，線粒體還參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是分離的還是體內(nèi)的線粒體都可以自發(fā)吸收和釋放鈣離子。那么，鈣離子是否在線粒體發(fā)揮生理功能中起到重要作用呢？事實(shí)上，人們對(duì)于這個(gè)問(wèn)題的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展歷程[5]。研究表明，鈣離子不但能被線粒體吸收和釋放，而且線粒體的鈣吸收和釋放在維持胞漿鈣穩(wěn)態(tài)中起到十分重要的作用[6]；線粒體內(nèi)自由鈣離子的濃度與其能量代謝水平和膜的通透性改變密切相關(guān)[7～9]；線粒體的鈣吸收和釋放過(guò)程也會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)進(jìn)行修飾[10]；該過(guò)程的異常與心臟病、癲癇和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生關(guān)系密切[11～13]。

線粒體是具有雙層膜的鈣存儲(chǔ)細(xì)胞器，鈣離子分布在其膜間隙和線粒體基質(zhì)中。由于線粒體外膜的鈣離子高通透性，膜間隙內(nèi)的鈣離子濃度與胞漿內(nèi)的鈣濃度相當(dāng)。在靜息狀態(tài)下，線粒體基質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度 (～100 nmol/L)與胞漿內(nèi)相當(dāng)[14]。當(dāng)細(xì)胞處于興奮時(shí)，胞漿內(nèi)的鈣濃度可以達(dá)到2～3μmol/L，而此時(shí)，線粒體基質(zhì)內(nèi)的鈣濃度可以上升至10μmol/L，甚至更高 (500μmol/L)[15,16]。那么，線粒體上存在哪些途徑來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子呢？

本文將結(jié)合最新研究進(jìn)展，就線粒體外膜鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)——線粒體外膜電壓依賴的陰離子選擇性通道 (voltage dependent anion-selective channel，VDAC)，線粒體內(nèi)膜鈣離子吸收——依賴單向吸收體的鈣離子吸收(mitochondrial calcium uniporter，MCU)、快速鈣離子吸收 (rapid mitochondrial calcium uptake，RaM)和依賴線粒體雷諾丁受體 (mitochondrial ryanodine receptor，mRyR)的鈣離子吸收，以及線粒體內(nèi)膜鈣離子釋放——鈉離子依賴(mitochondrial Na+-dependent calcium efflux，mNCX)和鈉離子非依賴的鈣離子釋放(Na+-independent calcium efflux，NICE)等鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)行綜述 (圖1)。

鈣離子穿梭線粒體外膜

線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道 (VDAC)是受線粒體外膜電勢(shì)調(diào)控的一類選擇性通道。目前發(fā)現(xiàn)人源線粒體中構(gòu)成通道的蛋白存在VDAC1～3三種形式[17]，它們有著組織表達(dá)差異性[18]，且能夠與不同的調(diào)節(jié)蛋白相互作用而行使功能[19～21]；VDAC是許多陰離子、陽(yáng)離子和線粒體代謝底物的轉(zhuǎn)運(yùn)通道，這其中也包括鈣離子[22～24]。那么，VDAC是怎樣運(yùn)輸鈣離子的呢？脂質(zhì)體實(shí)驗(yàn)表明，開(kāi)放狀態(tài)的VDAC直徑大小在3～4 nm之間，能夠允許小于5 kDa的分子自由通過(guò)[25]；鼠VDAC1-Ca2+晶體結(jié)構(gòu)及疊氮化釕 (AzRu)結(jié)合顯示VDAC1中的兩個(gè)谷氨酸即為鈣離子結(jié)合位點(diǎn)[26,27]；Rapizzi等[28]在HeLa細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)VDAC1時(shí)發(fā)現(xiàn)，在激動(dòng)劑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放的同時(shí)，線粒體內(nèi)鈣離子濃度升高的幅度高于對(duì)照組；反之，敲除VDAC1則線粒體內(nèi)的鈣離子濃度會(huì)降低。結(jié)合上述現(xiàn)象，Rizzuto等[29]認(rèn)為鈣離子可以自由穿梭VDAC，VDAC的拷貝數(shù)決定線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的能力。然而，Bathori等[30]發(fā)現(xiàn)VDAC的開(kāi)和關(guān)與鈣離子濃度密切相關(guān)。因此，相信VDAC轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子不僅依賴于VDAC的拷貝數(shù)，還存在調(diào)節(jié)孔道開(kāi)關(guān)的其他途徑。

鈣離子由膜間隙進(jìn)入線粒體基質(zhì)

鈣離子由膜間隙進(jìn)入線粒體基質(zhì)主要有三種方式，分別為依賴線粒體鈣離子單向吸收體 (MCU)的單向鈣吸收、快速線粒體鈣吸收 (RaM)，以及依賴線粒體雷諾丁受體 (mRyR)的鈣吸收。此外，研究還提示存在其他的鈣離子進(jìn)入途徑[31]，線粒體內(nèi)膜上負(fù)責(zé)鈣離子釋放的交換體在病理狀態(tài)下也可將鈣離子吸收至線粒體內(nèi)[32]。

依賴MCU的單向吸收

在依賴MCU的單向吸收過(guò)程中，鈣離子是單一的被吸收而不伴隨其他離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[33]；無(wú)論是氧化磷酸化、ATP水解還是鉀離子載體——纈氨酶素(valinomycin)建立的內(nèi)膜跨膜電勢(shì)都可以激活此吸收過(guò)程[34～36]；單向吸收動(dòng)力學(xué)方程具有電化學(xué)擴(kuò)散過(guò)程特征[36,37]。因此，鈣離子依賴MCU進(jìn)入基質(zhì)的過(guò)程是一個(gè)依賴于線粒體內(nèi)膜電勢(shì)、不需要額外能量、順鈣離子電化學(xué)梯度擴(kuò)散的過(guò)程。此外，據(jù)報(bào)道MCU只傾向于介導(dǎo)鈣離子的吸收而不介導(dǎo)鈣離子的釋放，因此，研究者將MCU稱為單向吸收體[38]。

單向吸收過(guò)程的抑制劑、激動(dòng)劑及動(dòng)力學(xué)特征

依賴MCU單向吸收的過(guò)程除了轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子外，其活性還受胞漿鈣離子濃度的調(diào)節(jié)，特別是當(dāng)胞漿鈣離子濃度持續(xù)上升時(shí)，其活性會(huì)受到抑制[39,40]。此外，其它離子、化合物及藥物類分子也可抑制此吸收過(guò)程，主要有：1)可以被單向吸收方式所轉(zhuǎn)運(yùn)的競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，如鍶離子 (Sr2+)、錳離子 (Mn2+)、鋇離子 (Ba2+)、亞鐵離子 (Fe2+)及鑭系元素離子(La3+、Gd3+和 Pr3+等)，MCU對(duì)它們的選擇為 Ca2+＞Sr2+?Mn2+＞Ba2+＞Fe2+＞La2+[38,41～43]。2)不能被單向吸收方式所轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑，包括：①鎂離子、氫離子和聚氨類，它們可能通過(guò)結(jié)合或屏蔽轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)而抑制鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[36]；②釕紅、釕360和六胺合鈷等強(qiáng)效型抑制劑，它們可結(jié)合MCU的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，從而起抑制作用。相比競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，這些強(qiáng)效型抑制劑具有長(zhǎng)效性且抑制常數(shù)Ki通常在10 nmol/L以下[38]；目前，釕360是抑制效應(yīng)最強(qiáng)、最為常用的抑制劑，突變?nèi)嗽碝CU的259位絲氨酸可消除其抑制作用[44]。3)藥物類抑制劑，包括Beta類抑制物[45]、胍類[46]和利尿類[47]等。

無(wú)機(jī)磷酸可以增加MCU吸收鈣離子的速率，但其中的機(jī)理目前還未知[48]。在線粒體外低鈣離子濃度條件下，包括精胺和亞精胺在內(nèi)的多胺類化合物可以激活MCU的吸收過(guò)程[49]，但所需濃度具有細(xì)胞依賴性[50]。此外，由于單向吸收過(guò)程對(duì)鈣離子具有協(xié)同性，因此，上述競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑在低濃度時(shí)也可起激活作用。值得注意的是，精胺在線粒體外高鈣離子濃度時(shí)反而對(duì)MCU具有抑制作用[51,52]。

單向吸收過(guò)程的動(dòng)力學(xué)方程為 V={[V max[Ca2+]H]/[K0.5H+[Ca2+]H]}×{(ΔФ/2)(eΔФ/2)/[sin h(ΔФ/2)]}。其中，V max為最大轉(zhuǎn)移速率，ΔФ與內(nèi)膜跨膜電勢(shì)相關(guān)，K0.5為解離常數(shù)，H為希爾系數(shù)[53]。研究發(fā)現(xiàn)，不同組織來(lái)源的、依賴MCU吸收鈣離子過(guò)程的V max存在差異性，有報(bào)道指出肝臟線粒體的Vmax要高于心臟線粒體[36]。早期研究發(fā)現(xiàn)分離線粒體的K0.5要大于10μmol/L[54～56]，因此，人們最初懷疑細(xì)胞內(nèi)的線粒體是否真的會(huì)通過(guò)此吸收模式來(lái)大量吸收鈣離子。Rizzuto等[57]對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的研究改變了人們對(duì)于細(xì)胞內(nèi)鈣離子分布的認(rèn)識(shí)。研究表明，細(xì)胞內(nèi)的部分線粒體會(huì)趨向定位于鈣微區(qū)的部位，這些區(qū)域的鈣離子濃度在興奮時(shí)可達(dá)到50μmol/L，甚至更高。因此，目前大家普遍接受細(xì)胞內(nèi)的線粒體可以通過(guò)MCU來(lái)吸收鈣離子的事實(shí)。根據(jù)分離線粒體的鈣離子吸收動(dòng)力學(xué)方程，人們推算出H為2；結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)，Gunter等[36]推測(cè)MCU存在一個(gè)鈣離子激活位點(diǎn)和一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)。然而，最近的研究顯示，細(xì)胞內(nèi)線粒體的單向吸收過(guò)程似乎對(duì)鈣離子具有更高的協(xié)同性——H約為3.2[58]。

MCU的分子機(jī)制

自單向吸收過(guò)程被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們一直力圖找出它的分子本質(zhì)。1972年，Sottocasa等[59]分離出一種被鑭和釕紅抑制的糖蛋白。1993年，Saris等[60]從鼠肝臟的線粒體內(nèi)膜體(mitoplast)上分離出一個(gè)40 kDa的糖蛋白，并檢測(cè)了其鈣離子吸收活性。1994年，Zazueta等[61]從鼠腎臟線粒體中分離出一種可以介導(dǎo)鈣吸收并被釕360所抑制的20 kDa蛋白。這些早期努力都未真正找到MCU。根據(jù)估算MCU的turnover數(shù)并與已知通道和載體蛋白的turnover數(shù)進(jìn)行比較，人們推測(cè)MCU可能是載體蛋白或門控通道[36]。2004年，Kirichok等[38]通過(guò)膜片鉗技術(shù)研究了COS-7細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜體 (mitoplast)的鈣通道，發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)膜上存在一種鈣離子高選擇性的內(nèi)向整流 (inwardly rectifying current)通道，并稱之為MiCa(mitochondrial calcium)通道；他們分析了MiCa通道的動(dòng)力學(xué)和抑制劑特征，認(rèn)為MiCa通道即為MCU。至此，人們第一次認(rèn)識(shí)到MCU是一個(gè)通道而不是一種載體蛋白。然而，MCU的基因篩查直到最近幾年才有了新的突破。

2007～2008年，Trenker等[62]和 Brookes等[63]通過(guò)對(duì) UCP2/UCP3(uncoupling protein 2/3)的研究，否定了它們作為 MCU的可能性，但同時(shí)也指出它們能夠影響線粒體的鈣離子吸收。2010年，Perocchi等[14]利用鼠源多個(gè)組織線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)——MitoCarta和基因定位 (gene mapping)手段，篩選出了人源線粒體中一個(gè)影響線粒體鈣吸收的基因MICU1(mitochondrial calcium uptake 1)。有趣的是，此前已報(bào)道的人類自身過(guò)敏源 (human autoallergen)Hom s 4即為MICU1，它與遺傳性過(guò)敏皮炎 (atopic dermatitis)密切相關(guān)[64]。人源MICU1含有三種剪切形式，全長(zhǎng)MICU1分子量為54 kDa且定位于線粒體內(nèi)膜上，具有一次跨膜螺旋和兩個(gè)鈣離子結(jié)合區(qū) (EF hand)，推測(cè)MICU1本身不能形成孔道，但具有調(diào)節(jié)MCU的功能[14]。隨后，Baughman等[44,66]和Stefani等[65,66]發(fā)現(xiàn)了存在于線粒體內(nèi)膜上、通過(guò)與MICU1相互作用而介導(dǎo)線粒體吸收鈣離子的MCU；MCU單體的大小為40 kDa，含有兩個(gè)跨膜螺旋，螺旋之間的連接處富含與鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的酸性氨基酸；根據(jù)非變性膠(native PAGE)結(jié)果，推測(cè)單體蛋白會(huì)以高聚的形式發(fā)揮鈣離子吸收功能。至此，人們才真正地找到了MCU的基因。隨后，Bick等[67]又分析了MICU1和MCU在不同物種中的分布情況，結(jié)果顯示兩者的關(guān)鍵區(qū)域在進(jìn)化中非常保守。目前，關(guān)于MICU1在調(diào)節(jié)線粒體通過(guò)MCU吸收鈣離子過(guò)程中的具體作用，存在兩種相反的觀點(diǎn)。一方面，Perocchi等[14]的研究顯示MICU1的敲除會(huì)降低線粒體的基礎(chǔ)鈣離子水平，MICU1敲除的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MICU1會(huì)恢復(fù)線粒體的鈣離子吸收，這顯示MICU1起激活作用；然而，Mallilankaraman等[58]發(fā)現(xiàn)在線粒體內(nèi)低鈣離子濃度條件下，MICU1抑制MCU吸收鈣離子，從而維持線粒體基質(zhì)內(nèi)較低的基礎(chǔ)鈣離子濃度，這又表明 MICU1起抑制作用。在發(fā)現(xiàn)MICU1后，Mallilankaraman等[68]及Plovanich等[69]又鑒定出了其它具有調(diào)節(jié)MCU功能的新分子，包括MCUR1(mitochondrial calcium uniporter regulator 1)、MICU2(mitochondrial calcium uptake 2)及MICU3(mitochondrial calcium uptake 3)，它們能夠與MCU相互作用而調(diào)節(jié)鈣的吸收。這使得我們相信線粒體通過(guò)MCU吸收鈣離子是一個(gè)高度復(fù)雜并受精確調(diào)節(jié)的過(guò)程。

雖然目前已經(jīng)鑒定出了MCU及其部分調(diào)節(jié)蛋白的基因，但仍有諸多問(wèn)題亟待回答，如：人源MCU具有3種剪切形式，擬南芥MCU也有6種剪切形式[70]，不同的剪切形式是否與MCU的組織特異性相關(guān)？MICU1～3的分布具有組織特異性[69]，不同組織的MCU活性是否與此相關(guān)？是否存在MCUR1及MICU1～3以外的調(diào)節(jié)蛋白？MCU轉(zhuǎn)運(yùn)鈣的分子機(jī)理是什么，其轉(zhuǎn)運(yùn)活性如何受到調(diào)節(jié)？VDAC是否與MCU相互作用來(lái)調(diào)節(jié)鈣吸收過(guò)程？UCP2/UPC3在線粒體鈣離子吸收過(guò)程中到底起什么作用？

依賴于RaM的快速線粒體鈣吸收

細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)通常是以鈣脈沖的形式出現(xiàn)，鈣脈沖峰值通常在1μmol/L。通過(guò)模擬細(xì)胞內(nèi)的鈣離子脈沖，可以測(cè)定鼠肝臟線粒體在不同鈣離子濃度下的鈣吸收曲線。結(jié)果表明，所有吸收曲線都很好地吻合單向吸收過(guò)程。然而，如果將吸收曲線的時(shí)間軸外推至零點(diǎn)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)線粒體在每一個(gè)脈沖開(kāi)始的短時(shí)間內(nèi)會(huì)吸收大量的鈣離子[71～73](圖2)；此吸收模式在哺乳類及鳥(niǎo)類的心臟、肝臟和大腦等組織中廣泛存在[10]。此外，估算發(fā)現(xiàn)，此吸收模式的速率為單向吸收的1000倍以上[74]，由此人們稱之為快速線粒體鈣吸收RaM。

和單向吸收過(guò)程一樣，RaM依賴于線粒體的內(nèi)膜電勢(shì)，可被解偶聯(lián)劑和釕紅等抑制(圖2)。此外，不同組織來(lái)源的線粒體的RaM存在差異性，特別是在抑制劑和激活劑方面[10,75]。

RaM可以被線粒體外高濃度的鈣離子所抑制，而當(dāng)鈣離子濃度降低到一定值 (鼠肝臟線粒體為100 nmol/L)時(shí)，RaM就可以在短時(shí)間內(nèi)再次被激活[74]。因此，根據(jù)RaM具有轉(zhuǎn)運(yùn)速率高、可以被低濃度鈣離子反復(fù)激活的特征，Gunter等[10]推測(cè)不處于鈣微區(qū)的線粒體在不能利用MCU單向吸收鈣離子的情況下，可以利用RaM調(diào)控ATP合成的速率，以滿足細(xì)胞的能量代謝需求。目前，RaM所依賴的分子機(jī)制研究進(jìn)展緩慢，通過(guò)對(duì)比RaM與MCU抑制劑及其動(dòng)力學(xué)過(guò)程，人們推測(cè)RaM可能為MCU的不同構(gòu)象[10,58]。

依賴于線粒體雷諾丁受體的鈣吸收

雷諾丁受體 (ryanodine receptor，RyR)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌質(zhì)網(wǎng)上負(fù)責(zé)將鈣離子釋放至胞漿中的一種鈣通道，且是已知最大的鈣通道 (>2MD)。目前已鑒定出三種雷諾丁剪切形式，分別是RyR1、2和3，它們會(huì)形成同源四聚體來(lái)行使通道功能[76]；三種剪切形式有著不同的藥理學(xué)特征和組織表達(dá)特異性[77]。相對(duì)于內(nèi)網(wǎng)上存在RyR的事實(shí)，線粒體內(nèi)膜 (嵴)上是否存在RyR目前仍處于爭(zhēng)論之中。利用免疫電鏡和免疫雜交等手段，Beutner等[78]發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)600 kDa大小的線粒體雷諾丁受體mRyR定位在鼠心臟線粒體嵴上，且與RyR1相似；由于線粒體存在內(nèi)膜負(fù)電勢(shì)，Beutner等及其他研究組[80,81]認(rèn)為mRyR在生理?xiàng)l件下行使線粒體鈣吸收功能，線粒體鈣過(guò)載時(shí)則會(huì)介導(dǎo)線粒體鈣的釋放，且其活性受胞漿內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。然而，Salnikov等[82]認(rèn)為鼠心臟線粒體嵴上不存在mRyR。此外，Uehara等[83]報(bào)道在鼠脾臟靜脈竇上皮細(xì)胞線粒體嵴上也存在mRyR，并與RyR3相似。因此，是否存在mRyR還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

MCU、RaM和mRyR的活性對(duì)鈣離子濃度的依賴是不同的——RaM在低鈣離子濃度下被激活，在高鈣離子濃度下被抑制；MCU在低鈣離子濃度下活性很低，在高鈣離子濃度下被激活；mRyR通道只有在一定的鈣離子濃度下才開(kāi)放，并受到線粒體內(nèi)膜電勢(shì)調(diào)節(jié)。依據(jù)MCU、RaM和mRyR的吸收動(dòng)力學(xué)特征，一種猜測(cè)認(rèn)為——在鼠心臟線粒體鈣離子吸收的最初階段，鈣離子濃度較低，鈣離子吸收以RaM為主；當(dāng)線粒體外鈣離子濃度逐漸升高時(shí)，RaM會(huì)被抑制而轉(zhuǎn)向以依賴mRyR和MCU為主的吸收[75,84](圖3)。但是，由于線粒體上是否存在mRyR還存在爭(zhēng)議，這個(gè)模型是否成立還值得商榷。

其他鈣吸收方式——人類心臟線粒體mCa1和mCa2電流

Michels等[85]于2009年通過(guò)膜片鉗技術(shù)鑒定出人類心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的兩種鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道電流——mCa1和mCa2。通過(guò)對(duì)其激活劑和抑制劑的研究，他們傾向于認(rèn)為mCa1就是MCU形成的通道電流，而mCa2形成的機(jī)制目前尚不清楚。

線粒體的鈣離子釋放

由于線粒體的內(nèi)膜存在負(fù)電勢(shì) (通常在－150～－180 mV之間)，其鈣離子的釋放必然是一個(gè)克服電化學(xué)梯度的過(guò)程。因此，鈣離子釋放過(guò)程需要與其他放能過(guò)程相偶聯(lián)。通常認(rèn)為線粒體可以通過(guò)以下幾種方式釋放鈣離子：1)鈉離子依賴的鈣離子釋放 (mNCX)；2)鈉離子非依賴的鈣離子釋放 (NICE)；3)其他釋放方式：DAG激活的陽(yáng)離子通道(DAG-activated cation-selective channel，DCC)和線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道 (mitochondrial permeability transition pore，mPTP)介導(dǎo)的鈣釋放。

鈉離子依賴的鈣離子釋放(mNCX)

mNCX主要存在于心臟、大腦、骨骼肌、腮腺等興奮組織，以及大多數(shù)癌癥組織中。mNCX介導(dǎo)Ca2+與Na+交換的過(guò)程中，Ca2+可以被Sr2+替代，Na+可以被Li+替代[86]。通過(guò)大量的研究，Brand等[31]認(rèn)為mNCX介導(dǎo)Na+與Ca2+交換的過(guò)程中，Na+與Ca2+的比例為3而不是2。地爾硫卓、氯硝安定及苯并硫氮雜卓類化合物 (例如CGP37157)可以作為mNCX的抑制劑，其中，CGP37157最為常用[87]。但是，這些化合物的抑制效果具有細(xì)胞類型依賴性[6,12]。此外，鉀離子和質(zhì)子對(duì)mNCX也具有一定的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用依賴于膜電勢(shì)[86]。

與MCU相似，mNCX的分子機(jī)制研究也一直進(jìn)展緩慢。1992年，Li等[88]從鼠心臟線粒體中分離出一種能夠介導(dǎo)鈉離子依賴的鈣離子釋放的、大小為110 kDa的蛋白。2004年，Paucek等[89]分離出了牛心線粒體中的Na+/Ca2+交換體。然而這些結(jié)果沒(méi)有得到重復(fù)。2004年，Cai等[90]通過(guò)對(duì)包括Na+/Ca2+的陽(yáng)離子/鈣離子交換體超家族 (Cation/Ca2+exchanger)的生物信息學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了該超家族中的一個(gè)新基因。隨后，他們對(duì)該基因進(jìn)行功能研究，發(fā)現(xiàn)它具有介導(dǎo)Na+/Ca2+交換的活性，且該活性依賴于鉀離子的存在，因此將其命名為NCKX6[91]。但是，Palty等[92]隨后發(fā)現(xiàn)NCKX6具有不依賴于鉀離子的Na+/Ca2+交換活性，且與mNCX一致的是，在交換過(guò)程中鋰離子可以替換鈉離子，因此，他們將其改稱為NCLX。2010年，Palty等[93]發(fā)現(xiàn)NCLX定位在線粒體嵴上，并能夠影響線粒體鈣的釋放。至此，人們推測(cè)NCLX可能就是線粒體mNXC的基因。

雖然已鑒定出線粒體mNCX的基因——NCLX，但目前關(guān)于NCLX的功能和結(jié)構(gòu)研究很少[92,94]，存在許多亟待解決的問(wèn)題。例如，鼠不同組織來(lái)源的NCLX蛋白表達(dá)水平的差異與相應(yīng)組織的mNCX活性并不線性相關(guān)[91]，那么，不同組織，特別是興奮組織的mNCX活性是否與NCLX的蛋白翻譯后修飾有關(guān)？另一方面，NCLX是否只定位在線粒體上？Cai等[91]發(fā)現(xiàn)表達(dá)在HEK293中的鼠全長(zhǎng)NCLX定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，而截短體定位在質(zhì)膜上，但Palty等[93]發(fā)現(xiàn)NCLX只定位在線粒體內(nèi)膜上。此外，NCLX存在分子量為70 kDa和55 kDa兩種剪切形式，它們都具有Na+/Ca2+交換活性，這兩種剪切形式的生理意義是什么[92]？NCLX介導(dǎo)鈣釋放的分子機(jī)制是什么且與其它通道介導(dǎo)的Na+/Ca2+交換區(qū)別是什么？

鈉離子非依賴性的鈣離子釋放(NICE)

在發(fā)現(xiàn)mNCX的同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)在肝臟、腎臟、肺和平滑肌等非興奮組織中存在鈉離子非依賴的鈣釋放途徑，即NICE。NICE除了能夠介導(dǎo)釋放Ca2+，還能夠釋放Sr2+、Ba2+和Mn2+。因此，人們認(rèn)為NICE不僅僅是鈣離子釋放的方式，而是線粒體內(nèi)二價(jià)離子釋放的統(tǒng)一模式[86]。研究表明，NICE介導(dǎo)鈣離子釋放是一個(gè)電中性的過(guò)程——即它介導(dǎo)兩個(gè)H+和一個(gè)Ca2+的相對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，人們認(rèn)為NICE介導(dǎo)鈣離子釋放所需能量完全等價(jià)于質(zhì)子運(yùn)輸過(guò)程中釋放的能量。但是，計(jì)算表明NICE釋放鈣所需的能量是質(zhì)子電化學(xué)梯度的3.5到47倍，因此推測(cè) NICE介導(dǎo)鈣釋放的過(guò)程中還需要其他的能量來(lái)源[95]。據(jù)報(bào)道，NICE除了可以被一些氧化抑制劑和解偶聯(lián)劑抑制外，還可以被釕紅抑制[86]。

迄今為止，關(guān)于NICE的分子機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。1998年，Villa等[96]分離出鼠肝線粒體中一個(gè)66 kDa的H+/Ca2+交換體。但后續(xù)研究沒(méi)有重復(fù)出該結(jié)果。2009年，Jiang等[97]在果蠅和HeLa細(xì)胞線粒體中發(fā)現(xiàn)Letm1(leucine zipper EF hand-containing transmembrane protein 1)可以介導(dǎo)H+/Ca2+交換，它可以在低鈣濃度下介導(dǎo)1個(gè)H+和1個(gè)Ca2+的交換。然而，Jiang等的研究?jī)H觀察到Letm1介導(dǎo)線粒體鈣的吸收——HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Letm1可以在激動(dòng)劑誘導(dǎo)下使線粒體內(nèi)鈣離子濃度上升。相反的是，Waldeck等[98]發(fā)現(xiàn)增加上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體外的鈣離子濃度時(shí)，過(guò)表達(dá)Letm1并不能使線粒體內(nèi)的鈣離子濃度上升。有趣的是，Dimmer等[99]發(fā)現(xiàn)在酵母細(xì)胞中敲除Letm1的同源基因Mdm38后，加入尼日利亞菌素(H+/K+交換體)可以使酵母恢復(fù)生長(zhǎng)，由此他們推測(cè)Letm1是一個(gè)H+/K+交換體，而不是行使H+/Ca2+交換的功能[66]。

其他鈣離子釋放途徑

膜片鉗實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在人腦線粒體中，二?；视?(diacyl glycerol，DAG)能夠激活對(duì)鑭敏感的陽(yáng)離子通道，說(shuō)明存在DAG激活的陽(yáng)離子通道DCC(DAG-activated cation-selective channel)。雖然體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明DCC能夠介導(dǎo)線粒體釋放鈣離子，但在DCC單獨(dú)重組的脂質(zhì)體實(shí)驗(yàn)中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其具鈣轉(zhuǎn)運(yùn)活性。結(jié)合電導(dǎo)和抑制劑實(shí)驗(yàn)，研究者推測(cè)DCC參與的線粒體鈣離子釋放需要除DCC以外的其他分子參與[75,100]。

已有的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明，線粒體內(nèi)膜上已知的鈣離子釋放途徑的釋放速率小于其吸收速率，因此，必然存在其他的鈣離子釋放途徑，以避免正常線粒體的鈣過(guò)載。有人認(rèn)為線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道m(xù)PTP可以通過(guò)在短暫的開(kāi)放和關(guān)閉之間進(jìn)行跳躍 (Flicker)，來(lái)參與正常線粒體的鈣離子釋放[10]。但是，mPTP是否行使鈣離子釋放仍然是一個(gè)疑問(wèn)——mPTP是一個(gè)高通量、低選擇性的激活孔道，它可以被高濃度鈣離子激活而開(kāi)放；然而，當(dāng)mPTP被持續(xù)性激活后就有可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9,101]。因此，研究者認(rèn)為即使mPTP以Fliker形式參與正常線粒體的鈣釋放，它也需要精確的調(diào)控。

線粒體鈣離子吸收釋放與疾病

由于線粒體內(nèi)的鈣離子濃度會(huì)影響線粒體ATP的合成、線粒體mPTP的開(kāi)放、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣信號(hào)及胞漿鈣穩(wěn)態(tài)的維持。因此，保持正常的線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力具有重要生理意義，它的異常與許多重要疾病相關(guān)。

無(wú)論是在缺血/再灌流還是在缺氧/再供氧的情況下，肌細(xì)胞線粒體內(nèi)的鈣離子濃度都會(huì)增加，這或者增加心肌細(xì)胞能量的供應(yīng)，或者導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡。Griffth等[11]認(rèn)為，在缺氧狀態(tài)下，心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子濃度的增加是由于mNCX會(huì)逆轉(zhuǎn)而吸收鈣離子。Castaldo等[12]通過(guò)對(duì)大腦缺血、癲癇和老年癡呆情況下線粒體內(nèi)鈣離子的研究，發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)鈣離子濃度的變化與神經(jīng)細(xì)胞的存活密切相關(guān)。

在動(dòng)物模型中使用線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑來(lái)觀察線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)生理功能的影響，發(fā)現(xiàn)不同種類抑制劑的使用具有細(xì)胞類型依賴性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，使用釕紅、釕360、地爾硫卓、氯硝安定和CGP37157等抑制劑并沒(méi)有得到理想的效果，有時(shí)甚至得到相反的效果[6,12]。因此，人們迫切希望解決線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，以期獲得特異性的藥物來(lái)調(diào)控線粒體的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)。

結(jié) 語(yǔ)

鈣離子通過(guò)線粒體上的不同轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制穿梭于線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間，調(diào)節(jié)線粒體乃至整個(gè)細(xì)胞的生理功能。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，人們通過(guò)生化、電生理等方法研究了線粒體的各種鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，獲得了它們的離子選擇特異性、激活劑/抑制劑、動(dòng)力學(xué)、電導(dǎo)等多種特征，使我們對(duì)這些過(guò)程有了一定程度的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)，由于分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)手段的發(fā)展與成熟，人們對(duì)這些鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑所依賴的分子基礎(chǔ)有了一定的認(rèn)識(shí)。未來(lái)人們將通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)等手段，對(duì)不同組織來(lái)源的、諸如MCU依賴的鈣離子單向吸收和鈉離子依賴的鈣離子釋放等過(guò)程的分子機(jī)制做出深入的揭示，從而豐富人們對(duì)線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)平衡機(jī)制的認(rèn)識(shí)。此外，由于MCU、MICU1、NCLX等線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)基因的鑒定，線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的研究將從傳統(tǒng)的細(xì)胞水平轉(zhuǎn)向分子水平，從而更直接準(zhǔn)確地闡釋線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的生理功能。同時(shí)，由于線粒體處于不斷融合分裂和沿細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜等細(xì)胞器在時(shí)空上存在著密切的關(guān)聯(lián)，因此，線粒體的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)必定與這些細(xì)胞器上的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)并相互作用和影響，這也將成為下一步的研究重點(diǎn)。

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