白藜蘆醇對哮喘小鼠氣道炎癥干預(yù)作用的研究

滕 鴻，劉躍建，胡 敏

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.四川省人民醫(yī)院呼吸科，四川 成都 610072;2四川大學(xué)華西第二醫(yī)院公共實驗室，四川 成都 610041)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和氣管平滑肌細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥;部分哮喘患者即使采用正規(guī)的糖皮質(zhì)激素和支氣管舒張劑治療，仍反應(yīng)不佳，最終影響疾病轉(zhuǎn)歸。因此，有必要探索新型藥物，作為哮喘治療有益的補充。白藜蘆醇(Resveratrol，3，4'，5 三羥基二苯乙烯)是一種在植物受到病原進(jìn)攻和環(huán)境惡化時產(chǎn)生的植物抗毒素，在中藥虎杖中含量豐富［1］，具有抗炎、抗氧化、抗癌、鎮(zhèn)咳、平喘、調(diào)節(jié)血脂等重要作用。2012年5月建立小鼠慢性哮喘模型，研究口服白藜蘆醇能否抑制哮喘氣道炎癥，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 哮喘小鼠模型的建立 雌性SPF級BALB/c小鼠18只，8～10周齡，分為白藜蘆醇組、陽性對照組、陰性對照組各6只。白藜蘆醇組、陽性對照組在第0、14天腹腔注射卵清蛋白(OVA)20μg(Sigma，溶于2.25 mg/100μl氫氧化鋁)。致敏結(jié)束后用1%OVA霧化。每周2次共5周。陰性對照組第0、14天腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)，生理鹽水霧化。白藜蘆醇組用白藜蘆醇灌胃(白藜蘆醇50mg/kg，用去離子水、花生油、羧甲基纖維素鈉、吐溫80配置成乳劑)，致敏結(jié)束后隔日1次。陰性及陽性對照組用溶劑灌胃。

1.2 標(biāo)本的制備與檢測 ①支氣管肺泡灌洗液和血清分析:末次OVA霧化12小時后，眶后靜脈采血，分離血清，–70℃凍存。用 ELISA試劑盒(Jingmei Biotec)檢測血清IL-4，IFN-γ和IgE含量。右肺用0.2 ml生理鹽水灌洗三次收集灌洗液，離心，瑞氏染色，計數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞。②組織學(xué)和免疫組化分析:末次OVA霧化12小時后將小鼠斷頸處死，切片(5μm)分別用蘇木素/伊紅(H.E.)和阿爾新藍(lán)/過碘酸希夫(AB/PAS)染色，PAS陽性細(xì)胞呈粉色，AB/PAS陽性細(xì)胞呈紫色。顯微鏡下計算AB/PAS陽性細(xì)胞占支氣管總上皮細(xì)胞的比例。ABC法(Vector)免疫組化染色，切片經(jīng)多克隆抗體(MMP-9、NF-кB)孵育，陰性對照用 PBS代替一抗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用F檢驗及q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對哮喘小鼠氣道慢性炎癥抑制作用 如表1所示，與陽性對照組比較，白藜蘆醇組灌胃后嗜酸性細(xì)胞明顯減少，肺部H.E切片的組織學(xué)分析結(jié)果與支氣管肺泡灌洗液的結(jié)果一致;陽性對照組的炎性細(xì)胞浸潤明顯增加。在OVA霧化時，白藜蘆醇組咳嗽、喘息和煩躁表現(xiàn)弱于陽性對照組。

表1 三組支氣管肺泡灌洗液(BALF)炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)(個/0.1ml)

2.2 白藜蘆醇對IgE和Th1/Th2細(xì)胞因子的影響白藜蘆組及陰性對照組與陽性對照組比較，IgE、IL-4水平降低(P＜0.05)。IFN-γ的水平的變化情況與此剛好相反，陽性對照組降低，經(jīng)白藜蘆醇灌胃后有所回升(P＜0.05)，見表2。

表2 血清 IgE、IL-4、IFN-γ 定量

2.3 白藜蘆醇抑制杯狀細(xì)胞的分泌 陽性組能觀察到較多的粉色和紫色細(xì)胞，顯示黏液分泌旺盛，AB/PAS陽性細(xì)胞比例分別為陰性對照組(3±2)%、陽性對照組(44±10)%、白藜蘆醇組(12±5)%(P＜0.05)。白藜蘆醇組粉色和紫色的信號強度更接近于正常小鼠的水平(圖1)。

圖1 粘多糖染色(×200)a:陰性對照組;b:陽性對照組;c:白藜蘆醇組

2.4 白藜蘆醇對 MMP-9和 NF-кB的影響 用ImageProPlus分析系統(tǒng)測定5個高倍視野陽性細(xì)胞面積及累積光密度IOD值，分別為陰性對照組2294±835、陽性對照組 4155±1750、白藜蘆醇組 3210±1146。和陽性組小鼠比較，白藜蘆醇組小鼠支氣管上皮細(xì)胞的MMP-9和NF-кB的表達(dá)量有明顯下降(P ＜0.05)(圖2、圖3)。

圖2 肺組織MMP-9染色(×200) 圖3 肺組織NFkB染色(×200)a:陰性對照組;b:陽性對照組;c:白藜蘆醇組

3 討論

白藜蘆醇能抑制花生四烯酸的代謝產(chǎn)物HHT、TXB2的形成。對于肥大細(xì)胞的炎癥介質(zhì)釋放過程，白藜蘆醇有非特異性的抑制作用。在體外實驗中，被IgE刺激后的肥大細(xì)胞所分泌的組胺、白三烯、前列腺素D2和TNF都被白藜蘆醇明顯地抑制［2］，因此白藜蘆醇具有抗炎、抗過敏作用。白藜蘆醇能提高一氧化氮合酶(iNOS)活性進(jìn)而導(dǎo)致一氧化氮(NO)含量增加。抑制細(xì)胞外鈣的內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放［3］。本文在小鼠的支氣管哮喘模型中，從行為學(xué)、病理學(xué)、血清學(xué)、細(xì)胞學(xué)等角度對白藜蘆醇潛在的治療效果加以評價。

實驗發(fā)現(xiàn)通過口服白藜蘆醇(50mg/kg)能在一定程度上抑制小鼠的哮喘癥狀如呼吸急促、咳嗽、煩躁;嗜酸性粒細(xì)胞的計數(shù)有明顯降低。白藜蘆醇組小鼠的支氣管平滑肌厚度變薄、炎性細(xì)胞浸潤減少;支氣管壁杯狀細(xì)胞分泌的粘多糖也有明顯減少。此外，哮喘相關(guān)的抗體(IgE)和細(xì)胞因子(IL-4、IFN-γ)水平都有相應(yīng)的變化，這些變化提示Th1和Th2細(xì)胞系之間的平衡在向不利于哮喘的方向發(fā)展。MMP-9在病理情況下如急慢性哮喘、慢性阻塞性肺病中表達(dá)量明顯增加［4］，而NF-кB能調(diào)節(jié)涉及哮喘病理生理的多種細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞黏附分子的分泌;已有文獻(xiàn)報道通過選擇性地抑制氣道上皮NF-кB的功能可減少OVA致敏的哮喘小鼠的粘液分泌［5］。免疫組化分析顯示哮喘相關(guān)蛋白比如MMP-9和NF-кB的表達(dá)量有所下降，提示白藜蘆醇能通過這些蛋白影響哮喘的病理生理過程。

富含白藜蘆醇的中藥虎杖在鎮(zhèn)咳平喘方面一直有較為廣泛的應(yīng)用。作為一種與Th1/Th2細(xì)胞因子失衡、氣道高反應(yīng)相關(guān)的急慢性氣道炎癥疾病，白藜蘆醇的多種生物學(xué)活性都能夠使之受益。本課題利用小鼠模型證明了白藜蘆醇在哮喘治療方面有一定的應(yīng)用前景。

［1］修清玉，唐昊.哮喘藥物治療進(jìn)展［J］.實用醫(yī)院臨床雜志，2009，5(4):95-97

［2］Seon-Young H.Inhibitory effects of dietary resveratrol on anaphylactic reaction and IgE-mediated allergic response in basophilic mast cells［J］.FASEB J，2010，24:723.

［3］Ekshyya N.Resveratrol inhibits rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation via estrogen receptor dependentnitric oxide production［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2007，50(1):83-93.

［4］Araujo BB.Extracellularmatrix components and regulators in the airway smooth muscle in asthmaEur［J］.Respir J，2008，32:61-69.

［5］Rico-Rosillo G.The involvement of NF-кB Transcription factor in asthma［J］.Rev Alerg Mex，2011，58(2):107-111.