酒精性癡呆大鼠模型的建立方法及評價

吳曉牧 曾玉娥 楊海玉

大腦是酒精誘導損傷的最常見靶器官之一，長期大量飲酒可引起腦器質性損害，并逐漸發(fā)展至癡呆狀態(tài)。酒精性癡呆（alcohol-associated dementia，AAD）是指由于長期飲酒導致慢性腦器質性損害而出現(xiàn)記憶缺損并伴有一種或一種以上認知功能受損的精神行為異常，同時可伴有震顫、譫妄、痙攣發(fā)作等神經功能障礙，記憶受損是其最重要和最基本的特征［1］。研究結果顯示酒精中毒已成為誘導癡呆發(fā)病的重要因素，AAD患者可占癡呆發(fā)病人群的21%～24%［2］。酒精可通過神經細胞毒性、氧化應激反應等途徑直接或間接誘導神經細胞發(fā)生凋亡，致使海馬區(qū)功能性神經細胞數(shù)目減少，從而導致學習記憶功能發(fā)生不完全可逆性損害［3］。目前，酒精誘導海馬損傷致學習記憶功能障礙的動物模型是用于研究AAD的公認模型。但在建立AAD動物模型的研究中，關于酒精作用的途徑、劑量和時間尚無統(tǒng)一標準，對動物模型的評價效果也各不相同［4－5］。本研究通過采用不同酒精干預途徑、劑量和時間建立AAD大鼠模型，并觀察大鼠行為學、海馬組織形態(tài)學變化以及神經細胞凋亡情況，旨在探討建立AAD動物模型的最佳方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 8周齡清潔級SD雄性大鼠53只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（合格證號：HNASLKJ20102186），體質量180～220g，按完全隨機區(qū)組法分為生理鹽水灌胃組〔n＝13，分為生理鹽水灌胃A組（n＝6）和B組（n＝7）兩個亞組〕、低劑量酒精灌胃組〔n＝18，分為低劑量酒精灌胃A組（n＝11）和B組（n＝7）〕、高劑量酒精灌胃組（n＝7）、生理鹽水腹腔注射組（n＝7）和酒精腹腔注射組（n＝8）。

1.2 方法

1.2.1 AAD模型的建立［5］：（1）低劑量酒精灌胃A組（n＝11）大鼠按體質量4mL／kg給予20%（體積分數(shù)）酒精灌胃，1次／d，連續(xù)28d；生理鹽水灌胃A組（n＝6）給予等量生理鹽水灌胃。（2）低劑量酒精灌胃B組（n＝7）和高劑量酒精灌胃組（n＝7）大鼠分別按體質量4、12mL／kg給予20%（體積分數(shù)）酒精灌胃，1次／d，連續(xù)14d；生理鹽水灌胃B組（n＝7）給予等量生理鹽水灌胃。（3）酒精腹腔注射組（n＝8）大鼠按體質量4mL／kg腹腔注射20%（體積分數(shù)）酒精，1次／d，連續(xù)14d；生理鹽水腹腔注射組（n＝7）給予等量生理鹽水腹腔注射。于每天給予酒精或生理鹽水之前稱體質量。

1.2.2 AAD模型的評價：（1）一般狀況觀察：每天觀察記錄大鼠的精神狀態(tài)、活動、睡眠、飲食、毛發(fā)和大小便情況。（2）Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）行為學檢測［6］：檢測動物從入水至尋找到平臺的時間，即逃避潛伏期（escape latency，EL），并以此作為衡量動物學習記憶能力的標準。實驗規(guī)定大鼠最長游泳時間為60s，如動物在60s內找不到平臺，則將其引導至平臺停留20s，記錄該次EL為60s。所有大鼠在開始給藥前均接受訓練5d。生理鹽水灌胃A組和低劑量酒精灌胃A組大鼠分別于灌胃7、14、21、28d后進行MWM行為學檢測；生理鹽水灌胃B組、低劑量酒精灌胃B組、高劑量酒精灌胃組、生理鹽水腹腔注射組和酒精腹腔注射組大鼠于灌胃14d后進行MWM行為學檢測。每只動物以3次游泳成績（分別從3個入水點記錄）的平均值作為該動物的EL。

1.2.3 大鼠海馬組織蘇木素－伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色：將生理鹽水灌胃B組、低劑量酒精灌胃B組、高劑量酒精灌胃組、生理鹽水腹腔注射組和酒精腹腔注射組大鼠于14dMWM行為學檢測之后處死取腦。給予濃度為10%（體積分數(shù)）的水合氯醛（批號：贛藥制字H20090014，江西省人民醫(yī)院藥劑科）腹腔注射麻醉大鼠，以40g／L多聚甲醛（批號：XK13-201-00153，上海潤捷化學試劑有限公司）灌流固定，之后取全腦以40g／L多聚甲醛固定24h，然后選取海馬部位切取厚度為2 mm的腦片，經脫水、透明、石蠟包埋，切取厚約4～6μm切片進行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察海馬組織形態(tài)結構改變。

1.2.4 大鼠海馬神經細胞凋亡檢測：選取大鼠海馬區(qū)進行組織切片，經脫蠟、水化處理后用PBS洗3次，然后每張切片滴加適量Hoechst33342染色液（貨號C1025，碧云天生物技術研究所）覆蓋組織，避光染色10min，PBS洗3次后封片，采用熒光顯微鏡（型號DM3000，德國徠卡公司）20倍鏡下觀察取圖。每只大鼠各選取1張切片，在每張切片雙側海馬的海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）和CA1區(qū)分別隨機選取3個視野，并進行凋亡神經細胞計數(shù)。凋亡細胞的特征表現(xiàn)為細胞核呈明顯固縮、濃染。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較選擇LSD檢驗（方差齊性）和Dunnett T3檢驗（非方差齊性）；兩均數(shù)間比較則采用t檢驗。取α＝0.05。

2 結果

2.1 行為學及體質量比較 高劑量酒精灌胃組大鼠精神狀態(tài)、活動能力及飲食等均較生理鹽水灌胃組和低劑量酒精灌胃組差。與生理鹽水灌胃組相比，高劑量酒精灌胃組14d后大鼠平均體質量明顯下降〔（259.57±3.22）gvs.（279.33±5.56）g，P＝0.03〕，而低劑量酒精灌胃組大鼠的體質量無明顯改變〔（278.10±3.94）g，P＝0.83〕。

2.2 MWM檢測結果 與生理鹽水灌胃A組相比，大鼠在給予低劑量酒精灌胃14d和28d后，其EL時間均顯著延長（表1）。生理鹽水組灌胃A組大鼠經過多次MWM行為學檢測后，其EL時間呈逐漸下降趨勢，而低劑量酒精灌胃組則無明顯改變（表1）。與生理鹽水灌胃B組相比，低劑量酒精灌胃B組大鼠的EL時間明顯延長〔（18.92±4.85）svs.（5.34±1.15）s，P＝0.02〕，而高劑量酒精灌胃組大鼠的 EL時間〔（9.55 ±2.30）s〕雖表現(xiàn)為延長趨勢，但結果并無統(tǒng)計學差異（P＝0.13）。酒精腹腔注射組大鼠14d后其EL時間較生理鹽水腹腔注射組延長〔（12.49±2.82）svs.（5.31±0.85）s，P＝0.04〕。

2.3 海馬HE染色觀察結果 生理鹽水灌胃B組大鼠DG和CA1區(qū)細胞結構清晰、完整，形態(tài)均一，細胞核未見異形、濃染等異常改變；而低劑量酒精灌胃B組大鼠海馬DG和CA1區(qū)可見大量散在分布的異常細胞，胞核固縮變形、濃染，細胞層數(shù)和密度均明顯減少（圖1）。高劑量酒精灌胃組和酒精腹腔注射組大鼠海馬DG和CA1區(qū)也可見到一些散在分布的異常細胞，而生理鹽水腹腔注射組未見異常。

2.4 海馬神經細胞凋亡檢測 生理鹽水灌胃B組大鼠海馬DG和CA1區(qū)細胞結構完整、形態(tài)均一，未見異形濃染凋亡細胞；而低劑量酒精灌胃B組大鼠海馬DG和CA1區(qū)可見大量聚集分布的異形、碎片狀致密濃染凋亡細胞（圖2）。與生理鹽水灌胃B組相比，低劑量酒精灌胃B組大鼠海馬DG區(qū)凋亡神經細胞數(shù)量（73.00±9.17vs.16.00±0.89，P＜0.01）和 CA1 區(qū)凋亡神經細胞數(shù)量（32.67±5.06vs.9.50±2.18，P＜0.01）均明顯增加；高劑量酒精灌胃組大鼠海馬DG區(qū)凋亡神經細胞數(shù)量（54.33±14.52）亦較生理鹽水灌胃B組DG區(qū)增加（P＜0.05），而CA1區(qū)凋亡神經細胞數(shù)量（21.17±3.10）雖有一定程度增加，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與生理鹽水腹腔注射組相比，酒精腹腔注射組大鼠海馬 DG區(qū)（52.67±23.50vs.14.33±1.76，P＝0.18）和 CA1區(qū)（10.67±2.03vs.11.67±0.88，P＝0.67）的凋亡神經細胞數(shù)量無明顯改變。

表1 各組大鼠MWM檢測EL比較 （±s，s）

表1 各組大鼠MWM檢測EL比較 （±s，s）

注：與生理鹽水灌胃A組相比，＊P＜0.05；與同組0d相比，＃P＜0.05

組別 n 0d 7d 14d 21d 28d F值 P值3.66 0.03低劑量酒精灌胃 A組 11 8.36±1.00 8.10±1.42 24.70±5.43＊ 12.59±2.78 8.15±1.07＊生理鹽水灌胃A組 6 9.44±1.30 10.42±2.06 5.68±1.30 6.82±2.55 4.52±1.14＃8.01 1.00

圖1 各組大鼠海馬組織HE染色結果

圖2 酒精誘導大鼠海馬神經細胞凋亡檢測結果（Hoechst33342染色）

3 討論

該研究結果顯示，低劑量酒精灌胃14d后大鼠即可表現(xiàn)明顯的學習記憶損害；而高劑量酒精灌胃雖然具有同樣的趨勢，但與生理鹽水灌胃組比較并無統(tǒng)計學差異。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)高劑量酒精灌胃組大鼠體質量增長、精神狀態(tài)、活動能力及飲食等均差于生理鹽水灌胃組和低劑量酒精灌胃組，提示酒精劑量過高可能嚴重影響機體其他系統(tǒng)的功能，例如酒精可直接損害胃腸道黏膜結構，進而影響胃腸道消化吸收等生理功能等。盡管高劑量酒精灌胃對海馬形態(tài)結構及神經細胞凋亡有一定損傷，但作者仍認為建模時不宜采取過高的酒精劑量和濃度。另外，雖然本研究結果顯示酒精腹腔注射亦可使大鼠EL時間顯著延長，但是從海馬神經細胞凋亡檢測結果來看，酒精腹腔注射的作用效果不明顯，提示酒精灌胃方法更適宜建立AAD模型。生理鹽水灌胃組大鼠在經過多次游泳訓練學習之后，其EL呈明顯縮短趨勢，提示動物學習記憶能力逐步增強；然而，低劑量酒精灌胃組大鼠并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。研究表明動物經過學習訓練可引起改變腦內突觸結構和功能的可塑性變化，而這種變化是增強動物學習記憶能力的重要分子機制。Xu等［7］研究發(fā)現(xiàn)學習可引起動物腦內新的突觸結構快速形成，并且重復訓練可以使新形成的突觸結構變得更加穩(wěn)定，訓練結束后也能持續(xù)較長時間。Yang等［8］也研究證實小鼠進行運動技能訓練后3個月，即使30%～40%新形成的突觸結構丟失，依然能維持先前學習的運動技能，且新形成的突觸存在越多，動物的記憶力越強，行為表現(xiàn)也越好。以上研究結果提示酒精可能通過影響突觸可塑性而干預學習記憶形成過程，其具體機制尚待進一步研究。

大量研究證實長期慢性飲酒可促使海馬體積減小及海馬區(qū)大量神經細胞凋亡，該機制與酒精誘導空間學習記憶功能障礙的發(fā)生密切相關。Oliveira-da-Silva等［9］對 出 生 后 30d 至 45d 的C57BL／6小鼠給予腹腔注射酒精發(fā)現(xiàn)，酒精作用可導致海馬大部分區(qū)域（包括齒狀回顆粒層及分子層、CA1、CA2和CA3區(qū)）的凋亡細胞數(shù)目增加，而且神經元及膠質細胞密度明顯減少。Vongvatcharanon等［10］對3月齡雌性成年Vistar大鼠給予低濃度和高濃度酒精作用3周至半年發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬區(qū)和扣帶回皮質氨酪酸能神經元減少和神經小膠質細胞增加，并且這種改變隨著飲酒時間的延長而增加。同樣，該研究結果也證實酒精作用可破壞大鼠海馬正常形態(tài)結構，誘導神經細胞發(fā)生凋亡，致使海馬神經細胞數(shù)目明顯減少，提示這些組織學改變與酒精損害學習記憶功能機制密切相關。

綜上所述，該研究建立的AAD動物模型不僅具有行為學和海馬組織學的明顯改變，而且在一定程度上反映了AAD的發(fā)病機制和功能變化規(guī)律。

［1］李舜偉.認知功能障礙的診斷與治療［J］.中國神經精神疾病雜志，2006，32：189-191.

［2］Smith DM，Atkinson RM.Alcoholism and dementia［J］.Int J Addict，1995，30：1843-1869.

［3］Silvia AL，Consuelo G.Molecular and behavioral aspects of the actions of alcohol on the adult and developing brain［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2011，48：19-47.

［4］Oliveira-da-Silva A，Vieira FB，Cristina-Rodrigues F，et al.Increased apoptosis and reduced neuronal and glial densities in the hippocampus due to nicotine and ethanol exposure in adolescent mice［J］.Int J Dev Neurosci，2009，27：539-548.

［5］Alijan-pour J，Abrari K，Lashkar bluki T.Acute ethanol administration affects memory reactivation：A look at the neuronal density and apoptosis in the rat hippocampus［J］.Pharmacol Biochem Behav，2012，102：321-328.

［6］Vorhees CV ，Williams MT.Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nat Protoc，2006，1：848-858.

［7］Xu TH，Yu XZ，Perlik AJ，et al.Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories［J］.Nature，2009，462：915-919.

［8］Yang G，Pan F，Gan WB.Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories［J］.Nature，2009，462：920-924.

［9］Oliveira-da-Silva A，Manh？es AC，Cristina-Rodrigues F，et al.Hippocampal increased cell death and decreased cell density elicited by nicotine and／or ethanol during adolescence are reversed during drug withdrawal［J］.Neuroscience，2010，167：163-173.

［10］Vongvatcharanon U，Mukem S，Udomuksorn W，et al.Alcohol administration during adulthood induces alterations of parvalbumin and glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in rat hippocampus and cingulated cortex［J］.Acta Histochem，2009，112：392-401.