病毒上清液促進(jìn)體外培養(yǎng)INS－1細(xì)胞系胰島素分泌

那日蘇，馬 聰，程園園，鄭旭磊，劉巧蕊

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海200031)

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activitor of transcrrption，STATs)是一類通過酪氨酸磷酸化激活的轉(zhuǎn)錄因子家族。STAT5是這一家族的重要成員，有STAT5A和STAT5B兩種異構(gòu)體，兩者具有高度同源性，它們可以在接受生長(zhǎng)激素、催乳素、干擾素以及促紅細(xì)胞生成素等多種激素或細(xì)胞因子刺激后，通過酪氨酸磷酸化偶聯(lián)形成二聚體，獲得進(jìn)入細(xì)胞核的能力，影響目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而廣泛參與細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。由生長(zhǎng)激素及催乳素介導(dǎo)的STAT5信號(hào)通路是胰腺β細(xì)胞中主要的信號(hào)傳導(dǎo)通路［1］。本研究擬利用反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的持續(xù)激活的STAT5A基因感染胰腺INS-1細(xì)胞來觀察STAT5的活性對(duì)INS-1細(xì)胞增殖及其分泌胰島素功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料:INS-1細(xì)胞及293T細(xì)胞(上海細(xì)胞庫(kù));胰島素放免試劑盒(中國(guó)原子能研究所);FuGENE6試劑盒(Roche公司);胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI1640培養(yǎng)液和瓊脂糖(GibcoBRL公司);蛋白酶K、RNase及四氮唑藍(lán)(methylthiazolyltetrazolium，MTT)(Sigma公司);磷酸化 stat5a抗體及actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 病毒上清液制備:反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的MSCV-EGFPSTAT5ADeltaN(R20)，即小鼠stat5a cDNA的1-136位氨基酸被剪切后獲得的具有持續(xù)激活功能的STAT5A，以及反轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCV-EGFP(EGFP)(Dr．Moriggl所贈(zèng))。將相同劑量的包裝質(zhì)粒DNA及R20或EGFP質(zhì)粒DNA混合后，按照FuGENE6試劑盒內(nèi)的操作手冊(cè)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 mL，72 h后收獲病毒上清。

1.3 病毒感染INS-1細(xì)胞:接種相同數(shù)目的INS-1細(xì)胞，分為EGFP對(duì)照組及R20即STAT5活性增強(qiáng)組。用先前制備好的病毒上清對(duì)應(yīng)各組進(jìn)行感染。

1.4 Western blot:兩組細(xì)胞被感染72 h后提取蛋白，BAC法測(cè)定蛋白濃度，常規(guī)Western blot操作。一抗:小鼠抗兔磷酸化STAT5A多克隆一抗，空白對(duì)照用小鼠抗小鼠actin單克隆一抗。獲得圖像后用quantity one軟件進(jìn)行分析，測(cè)定各條帶吸光度值，以磷酸化STAT5A條帶吸光度值/actin條帶吸光度值表示磷酸化STAT5A相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn):取兩組感染72 h后的INS-1細(xì)胞，按每孔約3×104接種于6孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)定3復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后吸去原有RPMI1640培養(yǎng)液，換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。在48 h時(shí)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。以490 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定每孔的吸光度值(A值)。

1.6 胰島素水平測(cè)定:將被EGFP及R20病毒上清感染后的INS-1細(xì)胞各分成3組分別置于葡萄糖濃度分為0、5.6、11.1及33.3 mmol/L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)刺激4 h后按照試劑盒說明書操作測(cè)定胰島素水平。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)磷酸化stat5a的表達(dá):被R20病毒上清感染后的INS-1細(xì)胞有磷酸化STAT5A的表達(dá)，而EGFP感染的對(duì)照組未測(cè)出(圖1)。

圖1 被MSCV-EGFP及MSCV-EGFP-R20病毒上清感染后的INS-1細(xì)胞中磷酸化STAT5A的蛋白表達(dá)Fig 1 Phospho-STAT5A protein expression in INS-1 cells infected by MSCV-EGFP-R20 compared with MSCV-EGFP

表1 不同濃度葡萄糖刺激4h后各組INS－1的胰島素分泌Table 1 Insulin releasing of INS-1 cells 4 hours after stimulated by different glucose concentration(±s，ng/L，n=3)

表1 不同濃度葡萄糖刺激4h后各組INS－1的胰島素分泌Table 1 Insulin releasing of INS-1 cells 4 hours after stimulated by different glucose concentration(±s，ng/L，n=3)

*P＜0.01 compared with 0 mmol/L;#P＜0.01 compared with MSCV-EGFP．

mmol/L MSCV-EGFP 0.185+0.004 0.353+0.006* 0.659+0.010* 0.846+0.006 group 0 mmol/L 5.6 mmol/L 11.1 mmol/L 33.3*MSCV-EGFP-R20 0.198+0.005 0.435+0.007*# 0.816+0.015*# 1.166+0.014*#

2.2 MMT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性情況:經(jīng)R20病毒上清感染的INS-1細(xì)胞的A值為0.658±0.007，顯著高于EGFP感染組的0.579及空白對(duì)照組的0.01。

2.3 放射免疫法測(cè)定胰島素分泌水平:在3種葡萄糖濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)刺激4h后，兩組細(xì)胞均可測(cè)到胰島素的分泌，且胰島素的分泌水平隨葡萄糖濃度的增高而增加;被R20感染的即有活性STAT5A表達(dá)的INS-1細(xì)胞系分泌的胰島素濃度高于EGFP對(duì)照組(P＜0.01)(表1)。

3 討論

β細(xì)胞功能衰減和胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。對(duì)于東方人群而言β細(xì)胞功能衰減更重要。胰腺β細(xì)胞功能的保持與細(xì)胞的數(shù)目及大小即β細(xì)胞群的多少有關(guān)，對(duì)動(dòng)物模型的研究和對(duì)人類胰腺組織的觀察發(fā)現(xiàn)胰腺β細(xì)胞群不是靜止不變的［2］，成年哺乳動(dòng)物的β細(xì)胞可以通過自我復(fù)制來獲得和補(bǔ)充正常群［3］。從治療的角度來看，在胰腺β細(xì)胞面臨代謝和免疫攻擊時(shí)驅(qū)動(dòng)β細(xì)胞的增殖、分化，抑制其凋亡，增強(qiáng)β細(xì)胞的存活能力從而增加患者的胰腺β細(xì)胞群有改善或治愈糖尿病的潛在可能。本實(shí)驗(yàn)利用反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的持續(xù)激活的STAT5A質(zhì)粒DNA來制備病毒上清感染胰腺腫瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞，從而獲得能表達(dá)高生物活性STAT5A的INS-1細(xì)胞。在STAT5A高活性的INS-1細(xì)胞中觀察到了比對(duì)照組增高的生長(zhǎng)活力。兩組INS-1細(xì)胞經(jīng)葡萄糖刺激后均有胰島素的分泌增加，而且在有高STAT5A活性的INS-1細(xì)胞中測(cè)到的胰島素分泌水平明顯高于對(duì)照組，提示STAT5A作為一種信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子，可能通過促進(jìn)胰島細(xì)胞的增殖分化來增進(jìn)其胰島素的分泌能力，這對(duì)于治療以胰島β細(xì)胞功能進(jìn)行性衰退為特征的2型糖尿病有積極的意義，但是這還需要進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

［1］Brelje TC，Stout LE，Bhagroo Nv，et al．Distinctive roles for prolactin and growth hormone in the activation of signal transducer and activator of transcription 5 in pancreatic islets of langerhans［J］．Endocrinology，2004，9:4162 －4175．

［2］Lee YC，Nielsen JH．Regulation of beta cell replication［J］．Mol Cell Endocrinol，2009，297:18 －27．

［3］Nir T，Melton DA，Dor Y．Recovery from diabetes in mice by β cell regeneration［J］．J Clin Invest，2007，117:2553－2561．