Kir4.1和AQP4基因多態(tài)性與顳葉癲癇遺傳易感性的關(guān)系

牛鳳鶴，林 華，李景云，朱席琳，伍曉盼，劉 英*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京100053)

癲癇是一種最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由腦部神經(jīng)元的異常放電引起。顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是成人局灶性癲癇中最常見(jiàn)的一種，其發(fā)生和發(fā)展受到遺傳和環(huán)境因素共同作用的影響［1］。鉀離子通道參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜靜息電位及動(dòng)作電位的復(fù)極化過(guò)程，決定動(dòng)作電位的發(fā)放頻率和幅度，阻斷或下調(diào)鉀通道可增加神經(jīng)元的興奮性。星形膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)向鉀離子通道(inwardly rectifying potassium ion，Kir)在維持神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境K+穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用，正常生理情況下，Kir通道在細(xì)胞外K+濃度升高時(shí)開(kāi)放，K+內(nèi)流，緩沖細(xì)胞外過(guò)度的鉀負(fù)荷，當(dāng)此平衡失調(diào)時(shí)，細(xì)胞外局部K+濃度大幅升高，K+的緩沖作用受損，引起癲癇的發(fā)作。Kir4.1為Kir的一員，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)鉀離子的平衡［2］。藥物難治性TLE患者的數(shù)據(jù)顯示，Kir的表達(dá)、定位和功能都發(fā)生一定程度的變化，尤其是 Kir4.1［3－4］。在化學(xué)誘導(dǎo)癲癇模型中，AQP4敲除鼠發(fā)生抽搐的頻率和程度要明顯低于野生型對(duì)照鼠［5］。這些都表明AQP4和Kir4.1與TLE的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前在中國(guó)人群中尚未有這兩個(gè)基因多態(tài)性與TLE易感性的研究。本研究旨在探討Kir4.1和AQP4多態(tài)性在中國(guó)漢族人群中與TLE遺傳易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究由兩組受試者組成，TLE患者(病例組)和非癲癇對(duì)照受試者(對(duì)照組)。TLE患者為2004年5月—2012年8月于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的患者，非癲癇對(duì)照受試者為2009年12月—2011年9月于北京協(xié)和醫(yī)院健康體檢人群。TLE受試者的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)1989年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟提出的癲癇綜合征的分類(lèi)。本研究已獲得受試者的知情同意和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院倫理審查委員會(huì)的審查同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集與DNA的提取:采集病例組和對(duì)照組受試者的外周靜脈血5 mL于已裝入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)－80℃保存。采用北京英瑞科技有限公司血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 SNPs的選擇與分型:從UCSC(http://genome．ucsc．edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得 Kir4.1 基因、AQP4 基因所在染色體位置及基因結(jié)構(gòu)信息并下載基因5'UTR上游2 000 bp至3'UTR下游1 000 bp的基因序列。隨機(jī)選擇24個(gè)TLE受試者和24個(gè)非癲癇對(duì)照受試者，對(duì)基因潛在的功能區(qū)域(包括啟動(dòng)子區(qū)，5'非翻譯區(qū)，3'編碼序列，3'非翻譯區(qū)，外顯子與內(nèi)含子的交界區(qū))進(jìn)行測(cè)序，共檢測(cè)到位于Kir4.1基因上的16個(gè)和位于A(yíng)QP4基因上的12個(gè)SNPs位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行基因連鎖分析并選擇劣勢(shì)等位基因頻率大于20%的SNP位點(diǎn)(rs3795339位點(diǎn)除外)，篩選的SNPs位點(diǎn)信息見(jiàn)表1。合成引物和探針(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行TaqMan分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用χ2擬合度分析來(lái)檢測(cè)SNPs位點(diǎn)是否符合HWE。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組等位基因和基因型的頻率。應(yīng)用在線(xiàn)軟件SHEsis分析連鎖不平衡和單倍型情況［6］。使用EPI6.0軟件計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)效力。

表1 候選基因SNPs位點(diǎn)相關(guān)信息Table 1 Information on single nucleotide polymorphisms analyzed in this study

2 結(jié)果

2.1 TLE病例組與非癲癇對(duì)照組的人口學(xué)資料

所有受試者均為中國(guó)漢族，病例組和對(duì)照組在年齡和性別上匹配。病例組中，伴海馬硬化113例，無(wú)海馬硬化325例;41例伴熱性驚厥，397例無(wú)熱性驚厥(表2)。

2.2 Kir4.1和AQP4基因多態(tài)性與TLE易感性的關(guān)系

病例組和對(duì)照組中SNP多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因的頻率分布情況見(jiàn)表3，基因頻率分布均符合HWE，多態(tài)性位點(diǎn)與TLE的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性。

表2 TLE患者與非癲癇對(duì)照組人口學(xué)資料Table 2 Demographic and clinical variables in TLE patients and non-epileptic controls

2.3 Kir4.1和AQP4單倍型以及分層分析SNPs與TLE易感性的關(guān)系

單倍型與TLE之間不存在相關(guān)性。結(jié)合臨床表型分層分析，TLE伴海馬硬化組與TLE非海馬硬化組和非癲癇對(duì)照組均無(wú)差異。TLE伴熱性驚厥組與TLE非熱性驚厥組和非癲癇對(duì)照組均無(wú)相關(guān)性。

3 討論

顳葉癲癇又稱(chēng)藥物難治性癲癇，目前所有抗癲癇藥物主要集中作用于離子通道上［7］。已證實(shí)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇腦組織中所發(fā)揮的功能提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可能能夠作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)［8］。

本研究選擇Kir4.1和AQP4這兩個(gè)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)的基因?yàn)楹蜻x基因，并未發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組的差異。而在歐洲和挪威人群中Kir4.1基因多態(tài)性與TLE易感性研究的報(bào)道指出，錯(cuò)義變異(R271C，rs1130183)與癲癇發(fā)作的易感性相關(guān)［9－10］。這種差異的存在可能由以下因素所致。第一，不同人群之間存在遺傳異質(zhì)性，本研究中中國(guó)漢族人群中兩個(gè)常見(jiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)rs3120973和rs3795339在歐洲人群中未有發(fā)現(xiàn)，而在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)與易感性相關(guān)的位點(diǎn)rs1130183在中國(guó)漢族人群未有發(fā)現(xiàn)。rs3795339位點(diǎn)與rs1130183兩個(gè)位點(diǎn)是毗鄰的，兩者分別將271位精氨酸變?yōu)榻M氨酸和半胱氨酸。此外，R271C多態(tài)性的功能學(xué)研究并未發(fā)現(xiàn)在通道結(jié)構(gòu)和功能上的變化［11］。第二，TLE是一種復(fù)雜的多基因疾病，受到眾多易感基因和復(fù)雜環(huán)境因素的影響，基因-基因交互作用或不同的基因產(chǎn)物之間的干擾可以彌補(bǔ)單一基因座變異所導(dǎo)致的不足?？傮w來(lái)說(shuō)，這些因素都可能會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果。

表3 Kir4.1和AQP4基因多態(tài)性在病例組對(duì)照組中的分布比較Table 3 Comparison of genotype distribution and allelic frequencies of SNPs in Kir4.1 and AQP4 between TLE patients and non-epileptic controls

續(xù)表3

本研究仍然存在一定的局限性，一方面，盡管制定了嚴(yán)格的入組標(biāo)準(zhǔn)并有專(zhuān)業(yè)醫(yī)師的診斷，但限于目前的臨床現(xiàn)狀仍有一定的不足。對(duì)于TLE的發(fā)展應(yīng)對(duì)患者接觸到的有害環(huán)境因素如腦外傷、腦炎等進(jìn)行綜合評(píng)估，然而，由于患者的記憶偏差等限制，完整的資料信息無(wú)法獲得，在以后的研究中這些條件都必須加以克服。另一方面，本研究中所選擇的SNP位點(diǎn)均位于潛在的功能區(qū)域，但可能也存在一些SNPs位點(diǎn)被遺漏。

本研究表明，Kir4.1和AQP4基因多態(tài)性與顳葉癲癇在中國(guó)漢族人群中并無(wú)相關(guān)性。但是，這兩個(gè)基因產(chǎn)物與其他蛋白之間通過(guò)相互作用來(lái)影響癲癇發(fā)生的可能性不能被排除，仍需要進(jìn)一步的研究。

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