B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的防治及對植株的促生效果

馬利平，郝變青，王 靜，喬雄梧

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測研究所，山西省農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

辣椒（甜椒、辣椒）是人們?nèi)粘Ｉ畈豢苫蛉钡氖卟?，種植辣椒是各地菜農(nóng)的主要致富門路之一。辣椒種植面積的不斷擴(kuò)大，使得各地一年四季辣椒供應(yīng)源源不斷。但在辣椒生產(chǎn)中與其如影隨形的土傳病害如辣椒疫病、辣椒枯萎病及各種葉斑病始終是困擾菜農(nóng)的棘手問題。據(jù)2012年山西、河北上百個縣鄉(xiāng)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在連作多年的重茬地、自留種地、低洼下濕地，辣椒病害發(fā)病率一般在30%以上，遇雨水頻繁年份，植株死亡率多在60%～70%之間。辣椒疫病菌主要以卵孢子、厚垣孢子在病殘?bào)w或土壤及種子上越冬，其中，土壤和病殘?bào)w上帶菌率高，是主要的初侵染源。辣椒枯萎病菌主要以厚垣孢子在土壤中越冬，或進(jìn)行較長時間的腐生生活，主要通過灌溉水在田間傳播，也可隨病土借風(fēng)傳播。辣椒黑斑病菌雖多侵染葉片和果實(shí)，但土壤中和病殘?bào)w上是其主要越冬場所[1-4]。這幾種病害隨辣椒種植年限延長和管理不善會逐年加重，而土傳病害的防治藥劑屈指可數(shù)。近年來，隨著農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和安全意識的提高，許多高毒和殘效期長的化學(xué)農(nóng)藥被禁用和限用，更催生了生物農(nóng)藥的研發(fā)速度。而且生物農(nóng)藥源于自然，用于自然，一旦在土壤中建立優(yōu)勢，對土傳病原菌的拮抗和抑制作用是持續(xù)而穩(wěn)定的。加快研發(fā)新的生物農(nóng)藥品種對確保蔬菜安全生產(chǎn)具有十分重要的意義。

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測研究所的山西省農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)10多年篩選研制的廣譜促生生物農(nóng)藥B96-Ⅱ發(fā)酵液，經(jīng)多年多點(diǎn)試驗(yàn)得出，其對蔬菜枯萎病、疫病等土傳病害有明顯的防治效果，對多種蔬菜如蘆筍有明顯的促生效果[5-6]。為探明B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的防治效果，筆者就B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的防治及對植株的促生效果進(jìn)行了室內(nèi)、田間的系統(tǒng)試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 菌株、試劑及儀器

枯草芽孢桿菌B96-Ⅱ?yàn)樯轿魇∞r(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測研究所的山西省農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選、鑒定的廣譜拮抗菌[3]。B96-Ⅱ發(fā)酵液制作：B96-Ⅱ菌種經(jīng)斜面菌種培養(yǎng)、種子培養(yǎng)液、發(fā)酵培養(yǎng)液發(fā)酵，使菌種濃度達(dá)到1010～1011cfu/mL，最高可達(dá)1012cfu/mL。

病原菌培養(yǎng)：（1）辣椒枯萎病。病原為Fusarium oxysporum Lecht.f.sp.vasinfectum Snyd.et hans，學(xué)名辣椒鐮孢霉，屬半知菌亞門真菌。（2）辣椒疫病。病原為Phytophthora capsici.leonian，學(xué)名辣椒疫霉，屬鞭毛菌亞門真菌。（3）辣椒黑斑病。病原為Alternaria alternata（Fr.）Keissl.，學(xué)名細(xì)交鏈孢，屬半知菌亞門真菌。這3種病菌均由山西省農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。將辣椒疫病菌、辣椒枯萎病菌、辣椒黑斑病菌分別點(diǎn)接在0.4 cm厚、直徑9 cm的PDA培養(yǎng)平皿上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，菌絲基本布滿全皿。

所用試劑均購自太原市來寶生物工程有限公司。主要儀器有JD500-2型電子天平（沈陽龍騰）；MLS-3020全自動滅菌鍋（日本SANYOLabo Autoclave公司）；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱HDLRAPPARATUS公司）；OLYMPUSOP70顯微鏡（日本）。

1.2 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒枯萎病菌、辣椒疫病菌和辣椒黑斑病菌的平皿抑制效果

根據(jù)文獻(xiàn)[7]的生長速率抑制法預(yù)試驗(yàn)表明，起始濃度為100倍開始有差異。采用梯度稀釋法，用滅菌蒸餾水，將 B96-Ⅱ發(fā)酵液分別稀釋成 102，103，104，105，106，107，108倍 7 個系列濃度，并與 45 ℃的PDA培養(yǎng)基按比例混合均勻倒平皿，厚度為0.4 cm，使平皿中的 B96-Ⅱ發(fā)酵液終濃度為 10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8cfu/mL。將預(yù)先培養(yǎng)好的辣椒枯萎病菌、辣椒疫病菌和辣椒黑斑病菌分別用0.4 cm直徑打孔器打片，并接入含有不同濃度B96-Ⅱ發(fā)酵液的培養(yǎng)皿中，對照為空白PDA培養(yǎng)基，每處理設(shè)6次重復(fù)。放28℃恒溫箱培養(yǎng)，分別在3，7，14，21 d用十字交叉法記錄病原菌直徑。以生長速率為指標(biāo)，計(jì)算不同濃度下的生長速率抑制率。生長速率抑制率＝（處理后的生長速率-對照的生長速率）/對照的生長速率×100%。

1.3 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的田間防治效果

大田試驗(yàn)于2011—2012年2 a在山西省太原市清徐縣集義鄉(xiāng)進(jìn)行，該縣辣椒種植面積在1000hm2以上。辣椒移栽后1個月（6月20日），用稀釋500倍的B96-Ⅱ發(fā)酵液灌根，每穴灌500 mL，對照藥劑為500倍50%復(fù)方多菌靈，同時設(shè)空白處理。7月20日以同樣的方法進(jìn)行第2次處理，共2次。小區(qū)面積60 m2，每處理重復(fù)3次。調(diào)查方法為隨機(jī)抽樣，每小區(qū)調(diào)查10個點(diǎn)，每點(diǎn)取10株，記錄發(fā)病率，計(jì)算防治效果。

1.4 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒的促生效果

處理方法、取樣方法、取樣時間同1.3。測定指標(biāo)為植株高度、植株鮮質(zhì)量、每株結(jié)椒數(shù)、每株辣椒總質(zhì)量。經(jīng)與對照比較，計(jì)算促生效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 B96-Ⅱ發(fā)酵液不同濃度對辣椒枯萎病菌的平皿抑制效果

試驗(yàn)表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒枯萎病菌有強(qiáng)烈而明顯的抑制作用。預(yù)試驗(yàn)表明，B96-Ⅱ在100倍以上濃度，對辣椒枯萎病菌完全抑制。由圖1可知，B96-Ⅱ發(fā)酵液為100倍時，生長速率抑制率為93.22%，之后隨稀釋濃度增大，抑制效果略有下降，但下降幅度緩慢，在稀釋濃度為108倍時，其生長速率抑制率為62.71%。

2.2 B96-Ⅱ發(fā)酵液不同濃度對辣椒疫病菌的平皿抑制效果

試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒疫病菌有強(qiáng)烈而明顯的抑制效果。B96-Ⅱ發(fā)醇液在稀釋100倍時，辣椒疫病菌菌落生長緩慢，21 d菌落直徑不足2 cm；當(dāng)稀釋到108倍時，對辣椒疫病菌仍有抑制能力，生長速率抑制率為71.07%。

2.3 B96-Ⅱ發(fā)酵液不同濃度對辣椒黑斑病菌的平皿抑制效果

由表1可知，B96-Ⅱ發(fā)酵液在稀釋102～108倍時，對辣椒黑斑病菌都有很強(qiáng)的抑制能力，生長速率抑制率為91.74%～97.52%。辣椒黑斑病菌在含有拮抗菌B96-Ⅱ的PDA梯度培養(yǎng)基上普遍生長緩慢，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制力，培養(yǎng)21 d發(fā)現(xiàn)，B96-Ⅱ在高濃度處理平皿內(nèi)（如100倍液）的菌落直徑小于14 d直徑，其他處理菌落也偶見空斑，經(jīng)觀察屬于溶菌現(xiàn)象。

2.4 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的田間防治效果

于2011年8月26日辣椒病害發(fā)病盛期調(diào)查，用B96-Ⅱ發(fā)酵液500倍液2次灌根后，辣椒全田生長茂密，病株、死株很少，處理后35 d的防治效果為80.3%，處理后70 d的防治效果仍為78.3%，而復(fù)方多菌靈僅為8.4%（表2）。

表1 B96-II對辣椒黑斑病菌的平皿抑制效果

表2 B96-II對辣椒病害的田間防治效果

2.5 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒植株的促生作用

B96-Ⅱ?qū)苯分仓暧忻黠@的促生作用，具體表現(xiàn)為：植株生長茂密，分枝多而長，與相鄰田塊和本村、本鄉(xiāng)同期種植戶比較形成明顯的差異。抽樣測定，B96-Ⅱ處理區(qū)植株較空白對照整體生物量增加33.5%（表3）。B96-Ⅱ發(fā)酵液處理后，辣椒結(jié)實(shí)率高，果實(shí)大而厚實(shí)，果實(shí)病斑率和壞死率也相對減少。

表3 B96-II發(fā)酵液對辣椒結(jié)實(shí)率和植株生物量的影響

2.6 B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒植株的抗逆能力觀察

2011—2012年連續(xù)2 a試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，B96-Ⅱ發(fā)酵液處理區(qū)長勢好，辣椒厚實(shí)，不僅發(fā)病率低，而且生長期可延長20～30 d。辣椒在當(dāng)?shù)仄胀ǖ貕K10月上中旬生長期基本結(jié)束，植株干黃，而B96-Ⅱ處理田多在11月初植株才會出現(xiàn)干黃。另外，經(jīng)歷2012年10月初的寒潮后，意外發(fā)現(xiàn)，B96-Ⅱ處理植株抗寒能力增強(qiáng)。具體表現(xiàn)為同鄉(xiāng)相鄰近的辣椒田在寒潮過后，已泛黃的整株葉片脫落，枝條被凍干，僅剩光稈和干癟的辣椒，而B96-Ⅱ發(fā)酵液處理區(qū)只輕微受凍，葉片零星脫落，干枝或光稈株少，依然以綠色為主。產(chǎn)量測定結(jié)果表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液300～500倍處理區(qū)，辣椒干質(zhì)量與對照相比，可增產(chǎn)5%～15%。

3 結(jié)論與討論

本研究室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒枯萎病菌、辣椒疫病菌、辣椒黑斑病菌均有強(qiáng)烈的抑制作用。稀釋102～108倍均對3種病原菌菌絲有明顯的抑菌效果，尤其對辣椒黑斑病菌，在稀釋108倍時，抑制效果可達(dá)91.74%。說明B96-Ⅱ發(fā)酵液含菌量高（1011cfu/mL）且抑菌活性強(qiáng)。21 d的抑制效果表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液有持續(xù)不斷的抑菌作用。在室內(nèi)平皿培養(yǎng)條件下，對辣椒的3種病原真菌和B96-Ⅱ拮抗菌的生長都達(dá)到了最大限度的條件滿足。B96-Ⅱ發(fā)酵液在稀釋萬倍甚至上億倍時，雖然原始濃度不高，但由于B96-Ⅱ細(xì)菌繁殖速度快，很快建立了生長優(yōu)勢，因此，在3周或更長時間內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。

室內(nèi)試驗(yàn)為B96-Ⅱ發(fā)酵液在田間應(yīng)用濃度提供了依據(jù)。雖然在室內(nèi)人工條件下，B96-Ⅱ的有效稀釋濃度可達(dá)到1億倍之多，但在自然環(huán)境條件下拮抗菌的生存會受到各方面的壓力。有研究表明，B96-Ⅱ能在田間存活定殖，定殖率在1%左右，隨生長環(huán)境和土壤微生態(tài)條件而變化[8]。其他相關(guān)研究也表明，高效拮抗菌常常在實(shí)驗(yàn)室平板效果明顯，但在盆栽和田間效果不穩(wěn)定[9]，生防菌因受自然界的營養(yǎng)、溫度、濕度、酸堿度等諸多因素的影響，在田間存活率低，這也是效果不穩(wěn)定的主要因素。因此，田間使用濃度應(yīng)比室內(nèi)有效濃度高些。本研究田間試驗(yàn)選擇300～500倍的B96-Ⅱ發(fā)酵液灌根，35d的防治效果為80.3%，同期多菌靈為37.9%，70 d B96-Ⅱ發(fā)酵液的防效為78.3%，說明濃度基本合適。為進(jìn)一步提高B96-Ⅱ發(fā)酵液的使用濃度和對蔬菜土傳病害的防效，今后應(yīng)在田間使用方法（如移栽前蘸根處理等方法）、該拮抗菌的田間定殖能力、定殖條件、逆境適應(yīng)能力等方面進(jìn)行馴化研究。

本研究連續(xù)2 a試驗(yàn)表明，B96-Ⅱ?qū)苯分仓暧忻黠@促生作用，表現(xiàn)為：田間生長茂密，封壟效果明顯，與未噴施植株相比，抗衰老、抗低溫能力明顯提高。B96-Ⅱ發(fā)酵液對植株的促生作用與前期對蘆筍等蔬菜的促生作用相同[10]，促生機(jī)制正在研究中。經(jīng)室內(nèi)和田間試驗(yàn)表明，B96-Ⅱ發(fā)酵液對辣椒病害的防治效果較好，是一種值得開發(fā)的生物農(nóng)藥品種。

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