連花清瘟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

許紅輝，李曉燕，張永鋒，李正杰，李向軍

(河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035)

連花清瘟膠囊為我院自行研發(fā)的中藥六類新藥，具有自主知識產(chǎn)權(quán)，由連翹、金銀花、麻黃、甘草等藥味組方。為有效控制其內(nèi)在質(zhì)量，對方中金銀花、甘草、大黃、薄荷腦、麻黃進(jìn)行了薄層色譜(TLC)鑒別，并采用高效液相色譜(HPLC)法測定了制劑中連翹苷的含量[1]?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀;VWD紫外檢測器。連花清瘟膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號為110246);金銀花對照藥材(批號為 121060－200605)、綠原酸對照品(批號為110753－200413)、甘草對照藥材(批號為 121303－200502)、大黃對照藥材(批號為121249－200402)、薄荷腦對照品(批號為110737－200312)、連翹苷對照品(批號為 110821－200711)、鹽酸麻黃堿對照品(批號為171241－200506)，均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈(Fisher，色譜純)，其余試劑、試藥均為分析純，水為樂百氏純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

金銀花:取本品6粒內(nèi)容物，加甲醇10 mL，超聲10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣用10mL水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用乙醚振搖提取2次，每次10mL，醚層棄去，水層用水飽和的正丁醇10mL振搖提取1次，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液;取金銀花對照藥材1 g，加甲醇8mL，超聲處理10min，過濾，濾液為對照藥材溶液;取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液;稱取處方量1/10、除金銀花外的方中藥材，按制備工藝制得陰性樣品，按供試品溶液的處理方法處理，制成金銀花陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述4種溶液各4～8μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯－甲酸－水(7∶2.5 ∶2.5)的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相對應(yīng)的位置上至少顯2個相同顏色的熒光斑點，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點;陰性對照無干擾(見圖1 A)。

甘草:取甘草對照藥材1 g，置具塞三角瓶中，加甲醇8mL，超聲10min，濾過，濾液作為對照藥材溶液;稱取處方量1/10、除甘草外的方中藥材，按制備工藝制得陰性樣品，按供試品溶液的處理方法處理，制成甘草陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典》(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取金銀花鑒別項下供試品溶液4～8μL，對照藥材溶液及陰性對照品溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)10℃以下放置的下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點;陰性對照無干擾(見圖1 B)。

圖1 主藥薄層色譜圖

魚腥草、大黃:取本品8粒內(nèi)容物，加乙醇10mL，超聲處理10min，取上清液作為供試品溶液。取大黃對照藥材0.1 g，加甲醇3mL，超聲處理10min，取上清液作為對照藥材溶液;另取魚腥草對照藥材0.5 g，加甲醇5mL，超聲處理20min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。稱取處方量1/10、除大黃或金腥草外的方中藥材，按制備工藝制得陰性樣品，按供試品溶液的處理方法處理，制成大黃或魚腥草陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄Ⅵ B]試驗，吸取上述溶液各4～8μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷 －乙酸乙酯 －甲酸(8∶2∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與魚腥草或大黃對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上至少2兩個相同的橙黃色熒光斑點或至少顯3個相同顏色的熒光主斑點(見圖2)。

圖2 魚腥草及大黃薄層色譜圖

麻黃:取鹽酸麻黃堿對照品適量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。稱取處方量1/10、除麻黃外的方中藥材，按制備工藝制得陰性樣品，按供試品溶液的處理方法處理，制成麻黃陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述對照品溶液與魚腥草或大黃鑒別項下供試品溶液各5～10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯 －甲酸 －水(20∶4∶0.5)的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相對應(yīng)位置上顯相同的紫紅色斑點;陰性對照無干擾(見圖1 C)。

薄荷腦:取本品4粒內(nèi)容物，加石油醚(60～90℃)5 mL，振搖2min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取薄荷腦對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。稱取處方量1/10、除薄荷腦外的方中藥材，按制備工藝制得陰性樣品，按供試品溶液的處理方法處理，制成薄荷腦陰性對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各4～8μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯 －甲酸(8∶2∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，105℃烘至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相對應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點;陰性對照無干擾(見圖1 D)。

2.2 連翹苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Agilent Zorbax SB － C18柱(150mm ×4.6mm，5μm);流動相:乙腈－0.1%磷酸溶液(22∶78);流速:1mL/min;檢測波長:205 nm;進(jìn)樣量:10μL。在此條件下，色譜圖見圖3。理論板數(shù)按連翹苷峰計算應(yīng)不低于3 500。

2.2.2 溶液制備

取連翹苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含4μg的溶液，即得對照品溶液。取本品裝量差異項下內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率為250W，頻率為40 kHz)20min，放冷，密塞，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，加在中性氧化鋁柱(100～200目，3 g，內(nèi)徑為1 cm)上，用水洗脫至25mL的容量瓶中，收集洗脫液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:稱取處方量1/10、除連翹外的方中藥材，按制備工藝制得陰性樣品，按供試品溶液的處理方法處理，制成陰性對照品溶液。按擬訂的色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果陰性無干擾(見圖3)。

線性關(guān)系考察:分別精密吸取質(zhì)量濃度為 1.647 6，2.746，5.492，10.297 5，13.73，20.595，68.65 μg/mL 的連翹苷對照品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測定，以連翹苷峰面積積分值為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=6.948X+29.016，r=0.9999 6(n=7)。結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在16.476～686.5 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液及相應(yīng)質(zhì)量濃度的供試品溶液，分別進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果對照品的 RSD為0.51%，供試品的 RSD為0.59%(n=5)，表明儀器精密度良好。

圖3 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗:分別精密吸取連翹苷對照品溶液、供試品溶液各 10 μL，于配制后 0，2，6，10，24 h 時測定。結(jié)果對照品、樣品中連翹苷峰面積的 RSD分別為0.66%和0.72%(n=5)，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同批次樣品9份，按低、中、高3個量級(0.4，0.5，0.6 g)取樣，每個取樣量各制備 3份供試溶液，依法測定。結(jié)果樣品中連翹苷平均含量為0.852 mg/g，RSD為1.46%(n=9)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗:取同批次已知含量的樣品9份，分為3組，分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的連翹苷對照品溶液，按供試品溶液制備方法制備待測溶液，依法測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

不同廠家及批號氧化鋁考察:取同一批樣品，按供試品溶液處理方法超聲提取、濾過后，各精密量取續(xù)濾液5mL，分別加在不同批次或廠家的中性氧化鋁柱(100～200目，3g，內(nèi)徑為1 cm)上，分別用水洗脫至25mL的量瓶中，依法測定連翹苷的含量。結(jié)果見表2。

表1 連翹苷加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

3 討論

大黃、魚腥草薄層色譜鑒別時，采用了同樣的供試品溶液，既縮短了樣品制備周期又節(jié)能環(huán)保;采用同樣的展開劑，簡便易行，節(jié)約了人力物力，且取得了較好的薄層色譜鑒別效果，故此項鑒別方法值得推廣。

含量測定選擇檢測波長時，對連翹苷對照品溶液進(jìn)行光譜檢測，結(jié)果連翹苷在200，227，277 nm波長處均有吸收，為降低樣品取樣量，故仍選擇205 nm為樣品的檢測波長。另外，洗脫溶劑采用水而不是不同濃度的乙醇、甲醇了[1]等化學(xué)試劑，更加節(jié)能環(huán)保，且降低了檢驗成本。

表2 不同廠家及批次氧化鋁考察試驗結(jié)果

綜上所述，文中建立的薄層色譜法鑒別專屬、斑點專屬，含量測定方法簡便、快捷、準(zhǔn)確、環(huán)保，適用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

[1]張雪光，宮立新，李雪松，等.高效液相色譜法測定雙黃連口服液中連翹苷的含量[J].中國藥業(yè)，2004，13(9):44 －45.